基于非靶向風味組學分析3 種品牌啤酒的風味差異

陳華磊，黃克興，鄭 敏，楊朝霞

（青島啤酒股份有限公司，啤酒生物發酵工程國家重點實驗室，山東 青島 266100）

啤酒作為世界第三大飲品，其富含人體所需的各種氨基酸、維生素及營養成分[1-2]，被譽為“液體面包”，它具有促進消化，增強脾臟活動，增加食欲等功能[3]。感官風味是啤酒重要的特征指標，由于生產過程中所使用的原料及釀造工藝不同，導致不同品牌啤酒風味上存在差異。消費者則根據其喜好，選擇適合的產品以滿足身心愉悅的需求。因此，準確區分不同品牌啤酒的特征風味對產品質量優化及真實性鑒別等研究存在重要意義。

眾所周知，不同品類啤酒（如Lager啤酒、小麥啤酒、黑啤酒、印度淡色艾爾啤酒等）間的風味存在較大差異，很容易通過感官加以區分。而相同品類啤酒則辨識度不及前者，但酵母菌種及發酵工藝的差異也對它們之間的風味造成細微差別，這些差異只有資深的忠實消費者或專業品評人員才有可能察覺。

近年來，頂空固相微萃取（headspace solid phase microextraction，HS-SPME）技術因具有良好的靈活性及選擇性[4-5]，被普遍應用于食品及啤酒等酒精飲料的揮發物研究[6-10]。隨著化學計量學的發展及高分辨質譜（high resolution mass spectrometry，HRMS）的廣泛應用，啤酒風味成分的檢測方法得到進一步優化，相關風味差異分析的研究也取得了相應進展。HRMS的超低檢測限使其成為鑒定痕量物質的首選。該技術已成為啤酒指紋識別及分類研究的有效工具[11-14]。

風味組學[15]是繼基因組學[16]、蛋白組學[17]、代謝組學[18]、食品組學[19]及感官組學[20]后又一新興的研究領域，是系統風味研究的重要組成部分，旨在分析樣品中全部小分子風味化合物成分及其動態變化。非靶向技術面向所有能檢測到的揮發性物質，全面反映整體風味變化，并通過多元統計分析篩選關鍵風味標記物。Gon?alves等[21]采用HS-SPME結合氣相色譜-質譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）及多元回歸分析建立啤酒原料中揮發物代謝組學的研究模式。Hughey等[22]利用高分辨質譜及組學技術繪制了工坊啤酒的分子指紋圖譜，并利用建立的數學模型對混合酒花釀造的IPA啤酒進行預測。Harmonie等[23]對160 個品種的傳統啤酒大麥進行非靶向組學分析，研究大麥品種對啤酒風味的影響。Tomá?等[24]進行捷克啤酒與捷克以外的其他歐洲啤酒的感官組學差異分析。

目前Lager啤酒仍然是啤酒消費市場的主流品類，本研究選取國內銷量最大、銷售范圍最廣的3 個品牌的Lager產品作為研究對象，利用HS-SPME-GC-MS結合風味非靶向組學技術對其風味差異進行研究。將樣品的質譜信息作為化學計量分析數據，利用主成分分析（principal components analysis，PCA）、偏最小二乘-判別分析（partial least squares-discrimination analysis，PLS-DA）法及隨機森林分類（random forest classifier，RFC）法提取相關信息，再結合組學原理對其結果進行分析，并參照國際標準質譜數據庫對關鍵風味化合物進行鑒定。本方法對類似的飲料風味的研究也同樣具有積極意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

收集國內A、B、C 3 種品牌的8?P Lager成品啤酒各8 批次，共計24 批次（表1）作為樣品置于4 ℃冰箱冷藏，待分析檢測時回溫至室溫。

表 1 樣品信息Table 1 Information about samples tested in this study

1.2 儀器與設備

50/30 μm二乙烯基苯/碳分子篩/聚二甲基硅氧（divinylbenzene/carboxen/polydimethylsiloxane，DVB/CAR/PDMS）萃取纖維 美國Sigma-Aldrich公司；6890 GC/5975A GC-MS聯用儀、HP-5MS色譜柱（60 m×0.25 mm，0.25 μm） 美國Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

啤酒樣品排氣后，取4.5 mL置于20 mL頂空瓶中，預平衡1 min，室溫萃取5 min。為驗證儀器的穩定性，本方法將測試樣品按等比例混合配制成質量控制樣品，與被測樣品同步進行分析。

1.3.2 HS-SPME-GC-MS條件

將50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取纖維在室溫條件下插入待測樣品的頂空瓶中進行頂空微萃取5 min，再將萃取纖維插入GC-MS系統的進樣口解吸5 min；使用HP-5MS色譜柱（60 m×0.25 mm，0.25 μm）進行分離；載氣為He，流速1.3 mL/min。升溫程序：初始溫度30 ℃，保持2 min；然后以2 ℃/min升溫至45 ℃，并以3 ℃/min升溫速率升至120 ℃保持2 min；最終以6 ℃/min升至230 ℃保持5 min。

化合物通過5975A EI-MSD進行質量分析：離子源溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃；電子能量70 eV；質量掃描范圍m/z29～550。將掃描所得質譜圖與美國國家標準與技術研究院頒布的標準質譜庫（NIST/EPA/NIH Mass spectral Library Version 2.2）進行比對，鑒別關鍵揮發物。

1.4 數據統計

將GC-MS原始文件進行數據預處理及統計分析。對于全掃描取得的數據，首先使用OpenChrom Community Edition (Version 1.3.0)將原始文件轉換為CDF格式，并對其進行過濾降噪，再利用解卷積功能對其進行色譜峰的鑒定與積分。

使用R語言XCMS軟件包將已積分數據進行樣本間色譜峰匹配、分組及保留時間校正與缺失峰填充，最終將得到的數據矩陣導出。使用SIMCA-P（Version 14.1，Umetrics AB，Sweden）進行多變量統計分析。應用PCA和PLS-DA構建數學模型。由于樣本數量的局限，選擇交叉驗證（cross validation，CV）方法進行模型驗證。通過參數的置換測試及方差交叉驗證分析（CVANOVA）計算特征變量投影重要性（variable importance for the projection，VIP）的不確定度，進一步評估模型的有效性及穩健性，并對VIP值進行排序。

2 結果與分析

2.1 樣品GC-MS測定

圖 1 3 種啤酒（A～C）及質量控制樣品（D）的總離子色譜圖Fig. 1 Total ion current chromatograms of three beer samples and quality control sample

首先采用不解析化合物的方法[25]對樣品中檢出的組分進行篩選。如圖1所示，樣品間的總離子流圖沒有視覺可見的明顯差異，很難通過傳統的GC-MS定性定量分析迅速直觀地確定其關鍵風味化合物。

將原始數據導入R語言XCMS軟件包，進行色譜峰識別、過濾及對齊處理，同時設置相應參數[26]，并得到包括質荷比、保留時間及峰面積等信息在內的數據矩陣。本研究最終獲得了1 751 個特征值，將其導出至Excel表格，再使用SIMCA-P 14.1軟件進行PCA及PLS-DA，結合MetaboAnalyst軟件篩選風味差異標志物，并進行后續統計分析。在此過程中原始數據通過預處理轉化為標準化數據的最佳替代模型。數據標準化后消除變量間量綱關系，為所有變量提供相似的權重，導致質譜特征的響應被均一化，因此來自低強度信號與高強度信號的相關信息以相同比例被測量。

2.2 PCA結果

本研究并未對所有組分進行定性定量分析，而僅將不同樣品間差異顯著的組分進行鑒別。GC-MS掃描的24 批次樣品，進行數據處理，最終將提取色譜峰響應值形成矩陣，并導入SIMCA-P 14.1進行PCA。

PCA用于初步篩查在全掃描模式下獲得的質譜信息，原始數據經XCMS軟件包進行峰識別、過濾、對齊等處理后導入SIMCA-P軟件進行PCA，將Ctr模式處理過的數據進行擬合，得到所有提取特征值的得分圖（圖2）。擬合后的方程提取了4 個主成分，包含原始數據中累計的信息，說明擬合度較好，但模型被解釋的總變量累計Q2=47.4%，這可能是受樣品化學組分及其基質背景中高豐度化合物的影響，使主成分的響應貢獻不明顯，不同品牌啤酒的信息可視化結構差異不顯著，結果導致分布在得分圖中不同品牌的啤酒未能有效區分。

由圖2可知，質量控制樣品的重復樣本間較為聚集，且位于得分圖中心原點附近，說明本實驗方法及儀器設備較穩定。此外，3 組樣品中除了A品牌的2 個樣品外，其他數據點都在95%的置信區間內，將上述偏離值剔除，并進一步進行PLS-DA。

圖 2 全掃描模式下提取信息的主成分得分圖Fig. 2 PCA score plot for extracted data in full scan mode

2.3 PLS-DA結果

圖 3 PLS-DA得分圖（a）與檢驗圖（b～d）Fig. 3 PLS-DA score plot (a) and permutation test graphs (b-d)

表 2 PLS-DA模型參數Table 2 Parameters of PLS-DA model

PCA只能反映樣品整體趨勢，不利于發現組間差異及具體化合物特征，因此需要通過PLS-DA更為準確地進行數據分析，挖掘組間細微差異[27]。

為了選擇需要識別的標記，建立有監督的PLS-DA模型，分類信息被納入分析。用Ctr算法進行數據轉換，樣品的特征信息在PC1上被有效分離，其占總方差的46.7%。PC2累計顯著性信息為73.2%，呈現的此類差異主要與樣品的不同釀造工藝所產生的風味指紋有關，因此可完成根據給定樣品特征的類別建模。與PCA相反PLS-DA以最大化分量獲得的方差構建主成分，PLS-DA潛在變量用以解釋樣本的組間差異。PC1和PC2有效區分啤酒的類別，其分別解釋了46.4%和52.5%的數據差異。如圖3a所示，A樣品較松散的位于圖上方區域；而B樣品緊湊分布在左側區域；C樣品分布于右下側較寬的區域。B啤酒的數據集較A、C更為集中，說明此品牌啤酒的GC-MS特征指紋更加均勻分布，這一發現與A、C啤酒比B啤酒富含更多種類的風味化合物一致。

本模型交叉驗證確認的22 個樣本都被正確分配，沒有假陽性或陰性的情況出現，具有良好的質量。PLSDA模型擬合方程參數見表2。其中Q2=0.844，均大于0.5，CV-ANOVA=1.430 6，且各參數間差異較小，說明擬合方程較為可靠。由圖3a可知，樣品組間有明顯差異，組內各數據點相對較為聚集，表明樣品間重復性好且較穩定。

當PLS-DA模型中的樣本數遠低于變量時，容易出現過擬合現象。為了評估模型性能，進行200 次置換檢驗，如圖3b～d所示。其中所有的Q2點從左到右均低于最右端的原始Q2點，其回歸線截距值分別為（0.302，-0.603）、（0.949，-0.118）、（0.323，-0.591），且Q2均小于0，說明該模型有效可靠[28]，未出現過擬合現象。

主成分得分圖的幾何分布僅給出了聚類趨勢，未能直接用于區分啤酒類別。結果顯示采用PLS-DA模型區分3 種品牌Lager啤酒間揮發物差異效果較理想。將模型中VIP值大于2，且P值小于0.05及倍數變化大于1.2的因子作為關鍵差異揮發物，如表3所示。

表 3 PLS-DA模型的關鍵化合物保留時間和m/z匹配Table 3 Retention time and m/z match of key compounds from PLS-DA model

2.4 RFC結果

RFC使用分類集合決策樹的策略，對每棵決策樹都通過從引導程序中隨機選擇特征產生每個樣本分支，類預測基于整體投票的多數。在決策樹構造期間，采用重復抽樣技術從原始樣本中抽取一定數量的樣本，并根據其計算待估的統計量T，經過N次重復抽樣，得到統計量T樣本方差。

本研究選擇A、B、C 3 種品牌Lager啤酒樣品建立RFC模型，并與PLS-DA結果進行相互驗證。圖4表明誤差率在400決策樹時已變得穩定，“袋外”誤差[29]使用給定參數誤差為0，因此選擇使用500決策樹構建RF分類器。

圖 4 隨機森林分類的累計錯誤率Fig. 4 Cumulative error rates of RFC

RFC模型除了提供變量重要性的衡量指標外（通過測量“袋外”誤差的增加評估其重要性），還可通過預測準確度評價標記物重要性。圖5給出了本RFC模型排名前列的關鍵標記物（表4），其順序按預測準確度降序排列，與PLS-DA選擇的關鍵標記物（表3）相類似。

圖 5 關鍵化合物重要特征平均精度排名Fig. 5 Average precision of important features of key compounds in increasing order

表 4 關鍵化合物標記特征平均精度排序Table 4 Key compounds listed in decreasing order of average accuracy of marker features

由表4可以看出，除十甲基環五硅氧烷是色譜柱流失及M174T2700、M159T2700因響應值太低無法定性外，其他關鍵性組分多為脂肪酸及其乙酯。

2.5 模型對比

選取3 種品牌Lager啤酒的不同生產批次樣品分別建立PLS-DA及RFC模型，并對其進行分類預測，準確度均為100%，如表5所示。辛酸乙酯、癸酸乙酯等物質在上述2 個模型中對被研究樣品分類均有積極貢獻，同時驗證了模型的有效性，可初步判斷此類物質是區分本研究所選擇的3 種Lager啤酒現階段風味特征的關鍵指標。

表 5 RFC和PLS-DA模型對啤酒分類結果Table 5 Classification results of beer by RFC and PLS-DA models

3 結 論

利用感官品評結合GC、GC-MS對特定揮發性成分進行定量分析是傳統啤酒風味研究的范式，它促進了人們對啤酒風味的理解，在一定程度上取得了成功，但由于其僅關注直接產生感官刺激的關鍵風味化合物，而忽略了其他潛在的具有調節風味活性的成分之間的相互作用，因此許多有用信息可能被忽略。本實驗使用的非靶向風味組學與數據挖掘技術豐富了啤酒風味解析的手段，對類似的飲料及酒類的風味研究及產品真實性判別的方法研究也起到積極作用。隨著分析儀器技術的進步可獲得更多維度的數據，為揭示啤酒中復雜風味化合物之間的相互關系提供了更多手段，從而更好地理解整個啤酒釀造過程對風味造成的影響。

本研究通過HS-SPME-GC-MS技術對啤酒中揮發物進行表征、分類及多變量分析，證實了DVB/CAR/PDMS萃取纖維及室溫5 min的萃取條件可適用于啤酒中揮發物的差異化研究，其中發現的部分關鍵風味物質在統計學上存在顯著性差異。與之前對不同風格啤酒[23]差異化組學分析相比本實驗進行相同品類啤酒風味區分的研究，雖然僅使用3 種特定品牌的Lager啤酒作為研究對象，但在一定程度上說明了不同釀造條件（如原料成分、糖化條件及發酵工藝等）可造成成品啤酒風味存在細微的差別。本方法也可設計針對每個工藝環節的特定樣本集，包括原料品種、種植環境及釀造過程中可能對成品風味造成影響的因素。