服用扶正抗癌方后非小細胞肺癌晚期患者CD8+T細胞細胞毒活性的變化

吳姍姍 王柏山 嚴峰 張寧 張程

(遼寧中醫藥大學附屬醫院臨床檢驗中心,遼寧 沈陽 110032)

肺癌已成為全世界范圍威脅人類健康，發生率和死亡率最高的腫瘤疾病，而且其發生率和死亡率還在持續升高〔1〕。其中非小細胞肺癌(NSCLC)約占85%,主要包括小細胞肺癌以外的鱗癌、腺癌、腺鱗癌等病理類型，早期并無明顯癥狀，多數病例在發現時已是晚期或發生轉移，所以生存率偏低〔2,3〕。近年新興眾多針對患者具體情況的個性化治療，但是大部分NSCLC仍發生轉移和復發〔4〕。研究發現扶正抗癌方不但可以提高機體對放、化療的敏感性，還可明顯降低其毒副作用〔5,6〕。扶正抗癌方可提升免疫力抵抗癌細胞抑制瘤體生長，但具體機制尚不清楚。CD8+T細胞又稱為細胞毒性T細胞(CTL)，CTL表面的T細胞受體與靶細胞上的抗原肽-主要組織相溶性復合體(MHC)Ⅰ類分子結合,CTL的溶解顆粒被轉運到與靶細胞的接觸點，穿孔素和顆粒酶B被釋放到CTL與靶細胞之間的免疫突觸中，上述釋放出的顆粒成分可作用于靶細胞并誘導其凋亡，對腫瘤細胞發揮免疫監視作用〔7〕。我們之所以認為CTL在抗腫瘤的過程中發揮重要作用主要基于以下原因:經常在腫瘤組織內發現CTL，患有腫瘤的小鼠進行過繼性的CTL移植對于腫瘤的治療是有效的，而且CTL效應機制的缺陷會提升罹患腫瘤的風險〔8〕。CTL通過釋放穿孔素和顆粒酶殺傷腫瘤細胞〔9〕。CTL如若表達CD107a可激活其自身脫顆粒，繼而分泌胞內穿孔素〔10〕。抗原特異性T細胞可分泌干擾素(IFN)-γ和腫瘤壞死因子(TNF)-α等多種細胞因子，上述細胞因子可以刺激腫瘤細胞上MHC Ⅰ類分子的表達，使CTL更靈敏的識別和殺傷腫瘤細胞〔11，12〕。因此顆粒酶、CD107a和IFN-γ可作為評價CD8+T細胞效應功能的指標。本研究旨在探索晚期NSCLC患者按療程規范服用扶正抗癌方前后CD8+T細胞細胞毒活性是否有改善。

1 對象與方法

1.1研究對象 選取2018年5月至2019年1月遼寧中醫藥大學附屬醫院31例有明確病理診斷的晚期NSCLC患者，男18例，女13例;平均年齡(45.5±3.8)歲，其中鱗癌14例，腺癌17例；TNM Ⅲa期8例，Ⅲb期11例，Ⅳ期12例，據服用抗癌方前后，分別定義為治療前組和治療后組。選擇21例健康體檢者作為健康對照(NC)組，男11例，女10例，平均年齡(42.3±3.5)歲。

1.2納入標準 納入標準：①符合原發性NSCLC診斷標準〔13〕，無其他腫瘤病史。②無激素或免疫抑制劑治療。③排除活動性感染。Karonfsky功能狀態(KPS)評分≥70分。

1.3藥物干預 扶正抗癌方(主要成分：苦參15 g，生白術12 g，生甘草5 g，半夏15 g，大貝20 g，半枝蓮15 g，白花蛇草30 g，茯苓20 g，陳皮15 g，生苡仁30 g)可根據具體情況辨證加減，醫院制劑科按標準流程制備，1劑水煎至150 ml/d，分早、中、晚3 次服用，30 d為1個療程〔12〕。

1.4實驗方法

1.4.1T 淋巴細胞絕對值 具體步驟： 20 μl BD公司CD4/CD8/CD3試劑加入絕對計數管中，逆向加樣50 μl外周靜脈全血，室溫避光15 min，加10倍稀釋免洗溶血素450 μl，室溫避光15 min，樣本溶血后FACSCalibur檢測，Multiset軟件分析。

1.4.2CD8+T細胞體外功能 具體步驟：用Ficoll-Hypaque提取外周靜脈血單個核細胞，單個核細胞用包含10%胎牛血清的RPMI1640調整濃度為2.0×105/ml，加入50 ng/ml的PMA和1 μg/ml的離子霉素，同時加入抗 CD107a 抗體和GolgiStop進行培養，孔板底部加入100 μg/ml的鏈霉素和100 U/ml的青霉素。37℃ 5%CO2濃度的培養箱孵育4 h，抗體CD3-PE/CD8-Percp做細胞表面染色。BD破膜試劑盒在4℃破膜30 min， 然后胞內染色 IFN-γ-FITC和顆粒酶B-FITC，最終用200 μl含1%多聚甲醛的磷酸鹽緩沖液(PBS)懸浮。FACSCalibur的Cellquest軟件檢測，FlowJo7.6軟件分析。

1.5生存質量評價 KPS評分評價患者的生存質量。提升：比治療前評分升高≥10分；平穩：治療前后評分變化幅度<10分；降低：比治療前評分減少≥10分〔14〕。

1.6統計學方法 采用SPSS20.0軟件進行Mann-WhitneyU檢驗、Spearman秩和檢驗。

2 結 果

2.1NC組與NSCLC治療前后CD4+T和CD8+T細胞絕對值比較 NSCLC組治療前后CD4+T細胞絕對值均顯著低于NC組(P<0.01)；NSCLC組治療前和治療后各指標比較差異無統計學意義(P>0.05)。NSCLC組治療前和治療后CD8+T細胞絕對值顯著低于NC組(P<0.01)；NSCLC組治療后CD8+T細胞絕對值顯著高于治療前(P<0.01)。見表1。

表1 治療前、治療后和NC組的比較〔M(Q25,Q75)，個/μl〕

2.2NC組與NSCLC組治療前和治療后CD8+T細胞細胞毒活性的比較 NSCLC組治療前和治療后CD107a+CD8+T細胞的百分比顯著低于NC組(P<0.01)；NSCLC組治療前和治療后比較差異無統計學意義(P>0.05)，見表1。NC組顆粒酶B+CD8+T細胞的百分比顯著高于NSCLC組治療前和治療后(P<0.01)；NSCLC組治療前和治療后比較差異無統計學意義(P>0.05)，見表1。NC組IFN-γ+CD8+T細胞的百分比顯著高于NSCLC組治療前和治療后(P<0.01)；NSCLC組治療后IFN-γ+CD8+T細胞的百分比顯著高于治療前(P<0.01)，見表1。

2.3不同TNM分期NSCLC患者各細胞水平比較 Ⅳ期患者CD4+T細胞、絕對值、CD107a+CD8+T細胞的百分比、顆粒酶B+CD8+T細胞百分比、IFN-γ+CD8+T細胞的百分比顯著低于Ⅲ期(P<0.01，P<0.05，P<0.05)，見表2。

2.4不同病理類型NSCLC患者各細胞水平比較 CD4+和CD8+T細胞絕對值、表達CD107a和釋放顆粒酶B及分泌IFN-γ的CD8+T細胞占百分比無論鱗癌還是腺癌，差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

2.5治療前組性別差異 CD4+和CD8+T細胞絕對值、表達CD107a、釋放顆粒酶B及分泌IFN-γ的CD8+T細胞占百分比性別比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 不同臨床特征NSCLC患者各細胞水平比較〔M(Q25,Q75)，個/μl〕

2.6相關性分析 NSCLC患者CD4+T細胞絕對值與CD107a+CD8+呈正相關(r=0.483，P<0.01)。

2.7生存質量評價 接受治療的31例患者KPS評分的改變，7例(22.6%)分數升高≥10分；19例(61.2%)分數升高<10分；5例(16.1%)分數減少≥10分。83.9%的患者治療后生存質量穩中有升。

3 討 論

中醫古籍雖沒有記載“肺癌”專病，但可歸為“肺積”“咯血”和“息賁”等。肺癌患者正氣內虛，虛損情況突出，應始終顧護正氣。肺癌進行放化療、靶向治療時均可輔以扶正補虛療法，研究證實可明顯增加放化療療效減低其毒副作用并且改善機體免疫功能〔5,6〕。Shankaran 等〔15〕研究發現CTL可抑制惡性實體瘤的生長。CD8+T細胞可通過一些細胞溶解酶(顆粒酶、穿孔素)和分泌細胞因子(IFN-γ)等對腫瘤發生免疫應答。

CD107a是溶酶體相關膜蛋白(LAMP)-1，只有當T細胞活化后發生脫顆粒才會暴露于細胞表面，CD8+T細胞一旦表達說明其發生脫顆粒〔16〕。Mittendorf等〔17〕將CD107a脫顆粒試驗與傳統的測定細胞毒性的51Cr釋放試驗進行比較發現：CD107a與51Cr釋放試驗一樣可以用于測定細胞溶解活性，并可應用于腫瘤研究。而且CD107a不具有放射性，不會污染環境，基于上述優點已被廣泛用于評價細胞的細胞毒活性。本研究結果說明NSCLC晚期患者CD8+T細胞的細胞毒活性和殺傷腫瘤細胞的能力均較健康人明顯降低。患者在服用扶正抗癌方后 CD8+T細胞的細胞毒活性可有提升但并未產生統計學差異，我們推測納入的樣本量偏少是可能的原因。而且CD4+T細胞絕對值高的患者其CD8+T細胞的細胞毒活性就高，提示其預后可能較好。

顆粒酶B主要存在于CD8+T細胞的顆粒內，必須依賴穿孔素才能破壞靶細胞〔18,19〕。Hodge等〔20〕研究發現，肺癌組織較非癌肺組織內的CD8+T細胞表達顆粒酶B的百分比顯著下降。這與我們在外周血中得出的結論是一致的，上述結論表明顆粒酶B+CD8+T細胞百分比的顯著減低直接影響CD8+T細胞破壞腫瘤細胞的功能。本研究發現服用扶正抗癌方后患者顆粒酶B+CD8+T細胞的百分比較服用前有所升高但無統計學差異，我們推測納入的樣本量偏少是可能的原因。

表達IFN-γ的Th1細胞可以介導對抗病原微生物的免疫應答，這種應答被認為有利于清除腫瘤細胞和助力抗原特異性細胞毒性反應〔21〕。IFN-γ除了誘導抗原提呈細胞的提呈作用，還可上調抗原提呈細胞上的MHC Ⅰ/肽復合物，使抗原特異性的CD8+T細胞再次發生活化和增殖，此時活化的腫瘤特異性CD8+T細胞可識別腫瘤細胞并向其釋放致死量的細胞毒性分子〔22〕。所以IFN-γ是抗腫瘤的核心細胞因子。上述證據表明扶正抗癌方能有效增加CD8+T細胞分泌IFN-γ，有利于消滅體內的腫瘤細胞。83.9%的患者服用扶正抗癌方后生存質量評價穩步提升也恰恰印證了這一事實。這與CD8+T細胞細胞毒活性的改善是密不可分的。

本研究結果表明NSCLC晚期患者隨著疾病的進展CD8+T細胞的細胞毒活性是逐漸下降的。但是CD8+T細胞表達CD107a、顆粒酶B及IFN-γ在鱗癌和腺癌之間以及不同性別間并無顯著性差異。

綜上，NSCLC晚期患者連續服用扶正抗癌方一個月，大部分患者生存質量可穩步提升，CD8+T細胞的數量增加并且其細胞毒活性提升，有利于患者預后。