米曲霉的次級代謝調控研究進展

侯莎，吳昌正，童星*

(1.佛山市海天調味食品股份有限公司，廣東 佛山 528000；2.廣東海天創新技術有限公司，廣東 佛山 528000)

米曲霉(Aspergillusoryzae)是半知菌亞門絲孢綱絲孢目從梗孢科曲霉屬中的一個常見種，在自然界中分布廣泛，主要分布于糧食、發酵食品、腐敗有機物和土壤中。米曲霉具有強大的蛋白分泌能力，能夠分泌蛋白酶、淀粉酶、糖化酶、纖維素酶、植酸酶和果膠酶等，被廣泛應用在醬油、豆豉、黃豆醬等多種發酵調味品的生產中。同時也是多種食品用酶制劑的生產菌株。經過多年實踐檢驗，其安全性被國內外普遍承認，更被美國FDA認定為公認安全的菌株(generally recognized as safe， GRAS)。

米曲霉等絲狀真菌在環境中分布十分廣泛，與人類的生活息息相關，在醫療實踐、農業生產及基礎生物學研究等方面扮演著十分重要的角色。絲狀真菌具有豐富的次級代謝網絡，其產物在醫藥領域具有相當的探究價值，包括有重要應用價值的抗生素、抗癌物質、降血脂藥物、免疫抑制劑等[1]。米曲霉基因組相比同屬的大30%左右，擁有更為活躍的代謝網絡。次級代謝是一個復雜的、多層次的調控過程，不僅受途徑特異性轉錄因子的調控，也受到全局性調控因子的控制，又與環境因子的影響密切相關。研究米曲霉次級代謝途徑，破譯其調控網絡，對于高效獲得具有應用價值的次級代謝產物，指導米曲霉的工業應用具有重大意義。

1 米曲霉的次級代謝產物

2005年，第一株米曲霉基因組由26家日本科研單位合作破譯，基因組大小為37 Mb，共有8條染色體，注釋12074個基因[2]。其大小相比同屬的構巢曲霉和煙曲霉分別大29%和34%，在水解酶分泌、氨基酸代謝和糖類轉運方面具有更為豐富的基因和通路，這為米曲霉產生豐富的次級代謝產物提供了基因基礎[3]。

米曲霉的次級代謝產物中不乏具有生理、藥理作用的活性成分，這些產物在米曲霉的進化及與其他生物和環境的相互作用密不可分。例如在化妝品中廣泛使用，具有美白抗氧化作用的曲酸[4]，不僅是多種美白產品的主要功能成分，還是頭孢類抗生素的原料，具有抑制酪氨酸氧化酶、多酚氧化酶、黃嘌呤氧化酶的作用。1990年Fefferle W P等從來源于土壤的一株米曲霉中分離獲得Asperfuran物質，研究發現其具有抗真菌活性[5]。Oryzachlorin于1969年從米曲霉中被分離，能夠強烈地抑制酵母菌的生長，但對細菌和絲狀真菌卻沒有抑制作用[6]。Aspergillomarasmine B，1965年Haenni等從米曲霉中分離出能夠影響植物原生質體的滲透壓，在后來的研究中也發現該物質對于血管緊張轉換酶和內皮素轉換酶具有抑制作用[7]。聶麗娟從米曲霉的菌絲體及培養液中分離鑒定出12種化合物，其中1個全新化合物，并發現其中4種對神經細胞具有保護作用和增殖影響，1種化合物對氧化損傷的SH-SY5Y細胞具有保護作用，3種化合物對金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌和大腸桿菌具有抑菌活性，并且發現菌絲體提取物對于金黃色葡萄球菌具有顯著的抑制作用[8]。被發現和報道的化合物只是米曲霉次級代謝產物的一小部分，更多活性分子仍有待發掘、驗證和開發應用。

2 米曲霉的次級代謝途徑的轉錄調控

絲狀真菌次級代謝產物的合成與調控是復雜的過程，涉及多步酶促反應，一般合成基因聚集成簇[9]，受到途徑特異性調控因子和全局性調控因子的雙重調控，又有表觀遺傳在其中發揮關鍵作用，同時也與溫度、濕度、營養條件等環境因子密切相關。米曲霉具備典型的次級代謝調控網絡，在轉錄過程、表觀遺傳以及環境因子等不同水平上均有多種蛋白質參與，形成復雜的多重調控系統。

2.1 途徑特異性調控因子

途徑特異性調控因子是次級代謝途徑功能基因表達的最直接調控方式，50%次級代謝途徑含有途徑特異性調控因子，一般位于基因簇內部。途徑特異性調控因子具有典型的轉錄因子的結構組成，包含DNA結合域和轉錄激活域。絲狀真菌的途徑特異性轉錄因子的DNA結合域包含一個典型Zn(II)2-Cys6模體，能夠識別存在于功能基因的啟動子區域中的一段特異性回文序列[10]，因此途徑特異性調控因子能夠結合在功能基因的啟動子區域，并由轉錄激活域招募通用轉錄因子完成轉錄激活。一般認為途徑特異性轉錄因子只能調控所在基因簇的表達，但是近來研究也發現有的還能調控其他途徑甚至多個途徑，使得不同途徑之間存在相互作用，次級代謝調控在最基礎的調控中也存在交叉與互作，其調控網絡的復雜程度可見一斑[11]。

除了有活性分子外，絲狀真菌的一部分次級代謝產物存在一定的生物風險，比如黃曲霉毒素(aflatoxin， AF)，主要由黃曲霉和寄生曲霉產生。值得一提的是，米曲霉雖然在種屬上與黃曲霉接近，但是卻從沒有檢測到黃曲霉毒素的產生[12]，這是由于米曲霉的黃曲霉毒素基因簇中存在著大片段缺失和多處突變所導致的[13]。其中途徑特異性調控因子aflR就存在多處突變，在有些米曲霉中aflR并不表達，有些能檢測到微弱表達[14]，但項目組通過RNAseq分析并用RT-PCR驗證發現大部分AF功能基因并未獲得表達(數據未公開發表)，這為米曲霉的安全性又增添了新的證據。

2.2 全局性調控因子

除了途徑特異性調控因子，米曲霉次級代謝途徑的轉錄調控還受到全局性調控因子的正向或負向調控，例如pH調控因子PacC、CreA，氮源調控因子AreA等。近年來研究最為廣泛的是受光照負調控的Velvet復合物，由LaeA、VeA、VelB 3個蛋白組成，對多種次級代謝途徑具有正向調控作用。主要蛋白LaeA是Bok等于2004年在構巢曲霉中發現的，啟動子和開放閱讀框中含有3個aflR結合序列和能夠參與組蛋白甲基化的S-腺苷甲硫氨酸結合序列[15]。LaeA不僅是組成Velvet三聚體主要的蛋白，能夠控制曲霉有性生殖和無性生殖的轉換，也是調控VeA、VelB及相關因子表達的關鍵因子。關于LaeA的作用機理，目前并沒有定論，可能的途徑有3種：一是通過組蛋白甲基化調控下游基因的表達；二是通過與途徑特異性調控因子的反饋調節作用控制次級代謝途徑功能基因的表達；三是通過G蛋白信號轉導途徑調控次級代謝與形態分化[16]。

此外，與分生孢子梗發育相關的C2H2轉錄因子BrlA也被證明具有次級代謝調控的功能，尤其是與孢子產生相關的代謝調控。BrlA缺失突變與無性孢子產生異常密切相關[17]。

Arakaug等于2019年通過米曲霉突變庫鑒定出一個Zn(II)2-Cys6型轉錄因子KpeA，具有全局性調控的功能，參與孢子發生和次級代謝調控。KpeA的缺失突變降低了無性孢子發生的核心調控因子BrlA的表達，在固體培養基上表現出氣生菌絲更長、分生孢子減少的表型。此外，相比對照菌株，KpeA突變株的曲酸含量提升了6倍，原因是在KpeA突變株中曲酸合成的途徑特異性調控因子KojR的表達得到了顯著提升。在LaeA缺失突變株中并沒有發現KpeA表達量的變化，證明KpeA的調控作用并不是通過LaeA途徑實現的[18]，也印證了KpeA全局性調控因子的身份。全局性調控因子是米曲霉次級代謝網絡響應外界刺激的紐帶，提升了細胞在不同環境中的適應性。

2.3 表觀遺傳調控

途徑特異性調控因子通過直接招募通用轉錄元件來啟動次級代謝基因的表達，全局性調控因子通過途徑特異性調控因子來影響功能基因的激活，而表觀遺傳調控則是通過染色體的結構變化來間接影響轉錄因子或者功能基因的表達，調控方式包括DNA甲基化、組蛋白乙酰化、甲基化和泛素化等，其中通過組蛋白修飾實現染色質結構重塑的研究最為廣泛。Kawauchi等鑒定出米曲霉中與酵母hst4同源的HstD基因，發現當HstD缺失時，米曲霉的生長受到影響，但是曲酸的合成量卻增加了近200倍，青霉素的產量也有顯著提升。進一步研究發現，HstD基因缺失的菌株中LaeA蛋白表達量上升，隨即引起下游代謝通路基因的高表達，最終導致代謝產物產量的提升[19]。

除了組蛋白乙酰化外，甲基化也是影響基因表達的關鍵修飾。Shinohara等在米曲霉中發現了與構巢曲霉cclA同源的基因和與釀酒酵母sppA同源的基因。CclA是組蛋白H3K4甲基化轉移酶復合物的組成部分，而SppA是與H3K4甲基化轉移酶相關的另一復合物的重要組成部分。這兩個基因的缺失影響了組蛋白H3K4的三甲基化，導致染色體狀態發生變化，影響相關區域基因的表達，最終導致次級代謝產物astellolide F產量的提升[20]。表觀遺傳調控在次級代謝調控網絡中是比全局性因子更上游的調控方式。

2.4 環境因子的調控

米曲霉中次級代謝途徑基因的轉錄調控和表觀遺傳調控均是響應環境刺激的結果，因此環境刺激對于次級代謝產物的產生十分重要。碳源、氮源、溫度、濕度、光照等這些環境因子均能引起米曲霉次級代謝的變化，而這種變化也是通過細胞內的轉錄因子或信號轉導來實現。例如，pH的影響通過調控因子PacC、CreA來介導，氮源的影響通過AreA來介導，高溫和光照能夠抑制Velvet復合物的活性，從而導致下游通路的表達減弱等。

環境因子的調控涉及的次級代謝通路更為廣泛，往往一種因子的變化通過細胞內信號通路的逐級放大，對多個代謝途徑產生影響。PARK等利用GC-TOF/MS與GC-MS聯用的方法檢測在合成培養基中不同溫度、不同pH、不同時間培養米曲霉所產生的代謝產物，發現46種初級代謝產物、76種次級代謝產物發生變化。存在變化的次級代謝產物包括支鏈脂質揮發性成分、苯系物等。直鏈揮發性脂質成分在高溫下顯著降低，而在低pH條件下呋喃類化合物的產生則顯著提升，這體現出不同的次級代謝途徑對不同環境因子的響應程度和方式并不相同[21]。

3 次級代謝產物的提升

活性次級代謝產物在原始菌株中的產生量往往并不豐富，加之復雜的提取工藝帶來的損失，導致活性成分的綜合得率很低，難以進行推廣應用。因此通過菌種選育、環境因子代謝調控和基因工程改造實現活性成分含量的提升，是米曲霉活性化合物走向應用的重要一環。

3.1 菌種選育

在工業應用中，目標分子產量的提升主要依賴傳統誘變的方法，誘變方法包括化學誘變、紫外誘變、微波誘變、N+離子注入誘變及常壓室溫等離子體誘變(ARTP)等方式。誘變的育種方式更容易被消費者所接受，對于研究并不深入的代謝通路，能夠快速獲得產量提升的菌株，同時也能產生豐富的突變為代謝通路的調控研究提供了資源。但誘變產生的基因變化具有隨機性，如何從大量的突變株中篩選出目標產物提升的菌株是整個過程的關鍵，也是限制誘變育種效率提升的重要瓶頸。

對于米曲霉來說，如何篩選優質菌株的問題更為突出，除了目標性狀篩選方法建立較難之外，通量化篩選更是面臨諸多瓶頸。米曲霉是絲狀真菌，液體培養時形成菌絲球，并不是分散的單細胞，難以通過在釀酒酵母或細菌中廣泛應用的微流控系統配合流式分選的方式進行通量篩選；固體培養狀態下也因菌絲蔓延導致交叉污染而難以實現通量化。舒冬梅等通過半固態培養基實現15株米曲霉的復篩是米曲霉通量篩選的首次公開報道，但是其篩選通量仍有待提高[22]。Feng等通過96孔板液體培養，獲得曲酸含量提升近3倍的米曲霉菌株[23]，但液態培養均一性及與工業應用場景的匹配性仍需進一步研究。因此，米曲霉的高通量篩選方法目前尚未形成穩定的技術，仍需科研工作者針對米曲霉的生長和應用特性進行深入研究，建立匹配工業應用場景的穩定方法。

3.2 環境因子代謝調控

以全局性調控因子及表觀遺傳調控為分子基礎，次級代謝途徑能夠響應多種環境因子的刺激，包括活性氧、碳源、氮源、溫度、濕度、光照、pH值等。因此，通過控制培養條件能夠最大程度激活功能基因的表達，引導細胞內的物質和能量向目標代謝通路轉移，獲得目標產物產量的提升[24]。環境因子的調控往往與代謝組學研究相結合，通過代謝組學方法發現與特定產物密切相關的環境因子，然后通過最陡爬坡法、響應面法對各個因素進行優化，獲得最佳的培養條件。

3.3 基因工程手段菌種改造

隨著測序技術及生物信息學分析技術的進步和人們對大數據處理能力的不斷增強，米曲霉功能基因組的研究迅速發展，加之CRISPR基因編輯系統的逐步完善，米曲霉的遺傳操作技術越發成熟，為利用基因工程和代謝工程來提高米曲霉次級代謝產物的產量提供了基礎。Tamano等在阻斷曲酸合成途徑的米曲霉中引入由kojA啟動子驅動表達的多酚合成酶，實現多酚的持續產出[25]。Shinohara等發現當染色質重塑因子cclA和sppA突變時，次級代謝產物astellolide F產量顯著提升。基因工程改造具有明顯靶向性，往往能夠在最短時間獲得較好的產量提升效果，但是往往依賴于遺傳操作系統的成熟度和代謝通路的前期研究基礎[26]。同時，基因工程育種需要關注菌株的生長狀況及與生產工藝的匹配性等問題，此外，在食品領域的應用仍受到一定限制。

4 結語與展望

在絲狀真菌的次級代謝研究中，米曲霉的研究基礎相對薄弱，原創性突破較少，深入而系統的研究更少，而且日、韓兩國的研究廣度和深度均超過我國。主要原因有兩點：一是米曲霉的遺傳操作并不十分成熟，調控機理的體內驗證耗時費力；二是我國學術研究與工業應用之間的銜接并不順暢，研究成果與工業需求并不匹配或者在工廠中難以復制和推廣，導致學者失去深入研究的動力。隨著技術的不斷發展和我國科技制度的改革，這些問題有望被逐漸克服，我國的米曲霉次級代謝研究也將會越來越系統和深入。

米曲霉次級代謝的多層次調控，其核心在于功能基因的表達調控，細胞外環境因子和細胞內基因的變化都將通過染色質結構、信號轉導及轉錄因子的變化，最終匯集到功能基因表達的調控上，形成環境刺激、表觀遺傳變化、全局性調控因子響應、途徑特異性調控因子作用、功能基因表達的多層次調控網絡。代謝組學在其中也發揮著重要作用，相比初級代謝，次級代謝對于胞內物質、能量、還原力等因素更為敏感，通過代謝調控能夠實現胞內物質變化和能量轉移向目標途徑傾斜，實現次級代謝產物產量的提升。隨著基因組學、轉錄組學和代謝組學的發展及米曲霉遺傳操作技術的成熟，次級代謝調控因子將逐步被發現和解析，調控機理也將會被慢慢揭示。對米曲霉次級代謝調控網絡認知的逐步深入，能夠有效指導人們更加合理地應用米曲霉的次級代謝產物，拓展米曲霉的工業應用范圍和場景。