醬油中呋喃酮類物質的研究進展

王嘉瑞，李青卓，張小龍，付彩霞，汪超，徐寧*

(1.湖北工業大學 生物工程與食品學院 湖北省食品發酵工程技術研究中心，武漢 430068；2.湖北土老憨生態農業科技股份有限公司，湖北 宜昌 443000)

醬油起源于中國，是由醬演變而來的，至今已有兩千多年的歷史。自周朝時期(公元前1046年-前256年)已經有了醬油的記載，元、明、清以后，醬油被廣泛應用于烹飪菜肴中，成為百姓日常生活中重要的調味佳品[1]。

醬油是以大豆或豆粕為主要原料，輔以面粉、小麥、麩皮等淀粉質原料，在微生物的發酵作用下形成的。醬油富含生理活性物質，在抗腫瘤、抗氧化、降低膽固醇、防治心血管疾病等方面都有重要的功效[2]。醬油的色、香、味俱全，含有多種揮發性風味物質，其中對醬香味貢獻最大的是呋喃酮類物質。呋喃酮類物質為醬油貢獻焦糖香味和醬香味，在醬油釀造過程中產生HDMF和HEMF，與酵母菌生長代謝息息相關，發酵條件的不同(底物、氨基酸、糖類、溫度、pH等)會極大地影響微生物的生長代謝，最終影響呋喃酮類物質的合成，從而影響醬油的風味品質。

1 醬油的風味物質

醬油的類型主要是由醬油的風味決定的，生產工藝及微生物種類和含量的不同會影響醬油的品質[3]。國內外研究者們采用不同的定性或定量方法已經鑒定出許多種對醬油風味有貢獻的風味物質，在中國傳統醬油、日本味噌、泰國魚露等中共有一千多種揮發性風味物質被檢測出。主要的揮發性風味物質包含酸類、醇類、醛類、酮類、酚類、酯類、吡嗪類、呋喃(酮)類、吡喃(酮)類、吡咯類、吡啶類、含硫化合物及含氮化合物等，其中報道10次以上的化合物有66種[4]，不同種類的醬油中風味物質的數量和組成差異很大。醬油特征香味中最突出的是焦糖香、烤香、果香、麥芽香，苯乙醇、2-甲基丁醛、3-甲基丁醛、2-甲基-1-丁醇、3-甲基-1-丁醇、異丁酸乙酯、3-甲硫基丙醛、苯乙醛、麥芽酚、HEMF(2個互變異構體)、葫蘆巴、HDMF和愈創木酚等為高鹽稀態醬油的關鍵香氣活性化合物，對醬油香氣貢獻最大。

在醬油制曲、醬醪發酵階段，揮發性物質發生顯著變化，制曲階段醛類物質累積，醬醪發酵階段酯、酸、呋喃酮類物質顯著增加，此過程中不僅生成對醬油香氣貢獻較大的揮發性風味物質，也為后續發酵提供各種酶類和揮發性風味物質前體物質。

呋喃酮類物質是醬油中香氣貢獻較大且種類較多的一類，主要在醬油發酵階段產生，其中最重要的兩種呋喃酮類化合物為HEMF和HDMF。HEMF是醬油焦糖香氣的特殊成分，在香味閾值較低時(水中0.02 mg/L)就能產生明顯的焦糖香、甜果香、醬香，HDMF也具有焦糖香氣，其在水中的風味閾值為0.16 mg/L，4-羥基-5-甲基-3(2H)-呋喃酮(HMF)和糠醛的風味閾值較高，但也能為醬油貢獻醬香味。

醬油風味的形成機制十分復雜，與原料種類、原料配比、菌種、生產工藝及管理技術等有關[5]。發酵過程中微生物生長代謝，會極大地影響醬油的風味和品質[6]。在醬油的高鹽稀態發酵過程中，除了會添加米曲霉外，還會添加乳酸菌、耐高鹽增香酵母菌等，在微生物的協同作用下，能產生有機酸、醇、酯等，這些菌株促成了發酵醬油中多種香氣物質的生成，能夠改善醬油的風味以提高醬油的質量[7-8]。較常見的耐鹽增香酵母菌有魯氏接合酵母(Zygosaccharomycesrouxii)、易變球擬酵母(Torulopsisversatilis)和埃切假絲酵母(Candidaetchellsii)[9]。醬油釀造過程中，魯氏接合酵母能夠通過生物合成途徑或者氨基酸分解代謝途徑形成乙醇、高級醇和4-羥基呋喃酮類等物質，調整醬油的香氣成分，影響發酵產品的口感，易變球擬酵母能產生酚類化合物如4-乙基愈創木酚和4-乙基酚，這兩種物質分別賦予醬油丁香香味和煙熏味，對醬油風味的形成起到重要作用[10]。

2 呋喃酮類物質

呋喃酮類物質是雜環香體類呋喃同系衍生物中極其重要的一類化合物，用途極為廣泛，是美國食用香料制造者協會(FEMA)認可的安全食用香料，我國《食品安全國家標準 食品添加劑使用標準》中也允許使用，被業界稱為“香料之王”[11]。

2.1 呋喃酮類物質的發現

HDMF最早是在1965年被發現的，Rodin等[12]在菠蘿中發現并用乙醚萃取液首次分離出了呋喃酮，確定了其分子結構式。1966年Henry等合成出HDMF[13]。1976年，HEMF首次在醬油中被分離出來，被認為是醬油香氣的主體成分[14]。隨后人們陸續從草莓、芒果、牛肉湯、烤面包、杏仁、榛子等物質中發現HDMF[15-16]，除了水果，某些昆蟲、細菌中也能分離出HDMF[17]，而HEMF主要存在于啤酒、味噌等發酵食品中。

2.2 呋喃酮類物質的應用

HEMF可用于醬油，增添獨特喜人的醬香味，并提升我國醬油的質量；可用于白酒，增加酒的醬香味，使其氣味醇厚，回味悠長；可用于果香型色酒，增加天然水果香味。HDMF是食品中重要的甜味香料和優良的增香劑，可用于味噌、啤酒和奶酪中，也可用于調配菠蘿、草莓、牛肉等食用香精，具有顯著增香、柔和及清新作用；用于牙膏及香煙中，能夠掩蓋雜氣，除辣味，改善味道及增強香味，醫學上還可用來預防及治療白內障[18]。

2.3 微生物發酵法產呋喃酮類物質

呋喃酮類物質在天然產物中含量很低，不能滿足日常所需，且提取純化成本較高，現在食品行業多以乳酸乙酯或1,2-丙二醇為原料制得呋喃酮。但化學合成法存在步驟多、產率低、溶劑殘留等問題。國內外研究多次報道在由酵母菌、乳酸菌等發酵的食品味噌、奶酪、啤酒等中發現或提取出HDMF，研究發現魯氏酵母、畢赤酵母、釀酒酵母、乳酸菌等微生物均能生成HDMF，魯氏酵母、埃切假絲酵母等還能夠產生HEMF。利用微生物發酵法制備呋喃酮可以通過調控微生物的生長代謝朝著呋喃酮產物合成的方向進行，且能夠實現目標產物的綠色生產[19]。因此，研究微生物生長代謝產生HEMF和HDMF增加釀造醬油中呋喃酮類物質含量是可行的。

3 HDMF和HEMF的形成機制

由表1可知，在醬油發酵過程中形成呋喃酮類物質主要有美拉德反應和酵母代謝兩種途徑。糖類物質和氨基酸通過美拉德反應可以形成HMF和HDMF，美拉德反應并不能直接生成HEMF，但能夠生成HEMF的前體物質，被酵母代謝生成HEMF。HDMF的生成大部分來源于美拉德反應，但也有一部分來自于酵母代謝，HEMF則主要是酵母菌代謝乙醛與美拉德反應中間代謝產物產生，HMF的形成與酵母生長無關，是幾種糖與磷酸鹽的非酶促反應形成。

表1 醬油發酵過程中幾種呋喃酮類物質的來源

3.1 美拉德反應途徑

糖類物質和氨基化合物在高溫下會發生美拉德反應，經過復雜的過程最后生成大分子物質，首先在酸性條件下經過1,2-烯醇化反應，生成羰基甲呋喃醛，隨后在堿性條件下經2,3-烯醇化反應，產生還原酮類和脫氫還原酮類，有利于Amadori重排產物形成1-氨基-1-脫氧-2-酮糖(1-deoxysome)，它是許多食品香味的前驅體，最后Strecker降解反應：繼續進行裂解反應，形成含羰基和雙羰基化合物，以進行最后階段反應或與氨基進行Strecker分解反應，產生Strecker醛類。

戊糖和己糖都可與甘氨酸和丙氨酸通過美拉德反應和酵母代謝生成HEMF和HDMF的過程見圖1。

圖1 HDMF和HEMF的形成途徑

通過美拉德反應，戊糖和氨基酸在加熱條件下產生Amadori化合物(a)，隨后通過2,3-烯醇化(b)形成C5-1-脫氧二酮糖，酮/烯醇異構化(C)，脫水環化(d,e)后形成HMF，己糖與氨基酸進行類似的反應形成C6-1-脫氧二酮糖后脫水環化形成HDMF[20]。

己糖可通過美拉德反應生成HDMF，戊糖可通過美拉德反應生成HMF，糖的碳骨架是形成呋喃酮類物質環形碳骨架的決定因素。美拉德反應生成HDMF和HMF是一種非酶促反應，此過程沒有酵母參與也能夠進行。美拉德反應產生的HMF前體物質與乙醛發生醇醛縮合(Knoevenagel縮合)(g,c)自發生成EDHMF，EDHMF能夠被酵母菌代謝產生的酶轉化成HEMF(i)。

3.2 酵母代謝途徑

HEMF的形成很可能與戊糖磷酸途徑的中間產物有關，戊糖磷酸鹽途徑是酵母產生HEMF最重要的途徑[21]。美拉德反應的中間產物C5-1-脫氧二酮糖可以與甘氨酸或丙氨酸的Strecker降解(f)產物甲醛和乙醛或者是糖片段化(h)產生的甲醛和乙醛通過2,3-烯醇化(b)形成C6-1-脫氧二酮糖和C7-1-脫氧二酮糖，隨后脫水縮合碳鏈環化(d,e)產生環狀中間體，通過酮/烯醇互變異構(c)還原成HDMF和HEMF，此步驟需要酵母菌參與代謝(i)，HEMF五元環的骨架和側鏈的甲基是由核糖形成的，乙基則來自于酵母利用丙氨酸Strecker降解產物(或是糖片段化(h)性的)乙醛[22]。戊糖和甘氨酸或丙氨酸通過美拉德反應和酵母代謝可以生成HDMF和HEMF。

草莓和番茄果實中有一種烯酮氧化還原酶，能夠催化HDMF的合成[23]。酵母中HEMF的形成是一種酶促反應，通過酵母菌產生的酶也可催化HDMF的生成。酵母菌內含有一種YNL134C基因，能夠編碼與植物的烯酮氧化還原酶(enone oxidoreductase)具有低序列同源性的醛還原酶，能夠調控HDMF和HEMF的合成。YNL134C基因編碼是一種醛還原酶活性的新型蛋白，由酵母細胞合成并釋放到體外，可以將多種醛還原成相應的醇，將糠醛和HMF解毒成毒性較低的2-呋喃甲醇(FM)和呋喃-2,5-二甲醇(FDM)[24]。糖類與氨基酸的美拉德反應產物、乙醛和NADPH在加熱條件下能夠生成EDHMF，在添加YNL134C編碼的酶后還原成HEMF[25]。此外，魯氏酵母中還含有17種與酵母生長代謝EMP途徑和戊糖磷酸途徑相關的基因，能夠影響HDMF和HEMF的生物合成[26]。

研究發現敲除YNL134C基因導致釀酒酵母HEMF產量下降。而多克隆表達該基因導致HEMF產量增加，因此可以通過找尋能添加到醬油釀造中包含類似于YNL134C基因編碼的醛還原酶以及類似植物烯酮氧化還原酶的基因的高產HEMF微生物來完善醬油中呋喃酮類物質的形成機制，也可以通過基因改造積累產生呋喃酮類物質的前體物質，通過調控微生物中催化HEMF和HDMF合成的酶的基因來增加HEMF和HDMF的含量[27]。

3.3 HDMF和HEMF合成的影響因素

HDMF的生成大部分來源于美拉德反應，在加熱條件下HDMF的含量明顯增加，加入酵母后含量無明顯變化。HEMF不能由美拉德反應直接產生，是由酵母菌代謝乙醛和美拉德反應中間產物生成。培養基的理化條件不同，如不同的底物、不同的氨基酸、不同的糖類添加、不同的接種方式、不同的生產工藝均會影響微生物的生長環境和生長代謝，最終影響HDMF和HEMF的合成。有研究表明，培養基的NaCl濃度和pH能影響魯氏酵母的生長代謝，在菌體能正常生長的前提下高鹽濃度更能促進HDMF和HEMF的合成，可能是高鹽條件下細胞通透性改變，對底物有更高的選擇性[28]。

在醬油體系中，魯氏酵母可利用不同的糖類和氨基酸類物質生成呋喃酮類物質，有研究表明添加五碳糖更能增加醬油的醬香味和煙熏味，可能是因為五碳糖不易被微生物生長作為能源，但卻是美拉德反應重要的前體物質，添加1,6-二磷酸果糖更容易被酵母菌利用，也能夠增加HDMF和HEMF的產量[29]。不同的氨基酸添加對酵母合成呋喃酮有不同的影響，除酪氨酸(Tyr)對C.etchellsii產HEMF有抑制作用外，其余19種氨基酸均有不同的促進作用，其中，丙氨酸(Ala)、精氨酸(Arg)、甘氨酸(Gly)和賴氨酸(Lys)的促進作用最明顯[30]。因此可以通過改變微生物的生長環境來影響微生物的代謝，讓結果朝著更有利于酵母菌生長和產生更多香氣成分呋喃酮的方向發展。

4 發展與展望

傳統的醬油釀造是指前人無意識地利用了自然的混菌發酵，由自然環境中多種微生物群體參與，微生物之間拮抗共生，產生了豐富的酶系，使傳統釀造的醬油具有很好的風味?，F代醬油釀造工藝往往是純種發酵，通過精準調控生產工藝來嚴格控制醬油的品質。目前人們對發酵醬油的工藝機理，尤其是發酵醬油用功能微生物缺乏深刻認識和系統研究。隨著生活水平的提高，人們對醬油風味的要求越來越高，醬油的風味已成為食品生產者和消費者關注的問題。原材料的配比、接種微生物的種類以及生產工藝決定了醬油的色、香、味。了解醬油風味物質的種類及其產生的機制對于如何改造耐高鹽增香酵母從而改善醬油風味及提高醬油質量至關重要，為進一步精準調控發酵調味品風味提供了思路。