酸棗幼根原生質體的制備

武延生,邢翠娟,李 敏,武麗娜,牛偉濤,張鵬飛,王僧虎

(1.邢臺學院生物科學與工程學院，河北 邢臺 054001；2.邢臺學院河北省邢棗仁利用技術創新中心，河北 邢臺 054001；3.邢臺學院邢臺市藥用植物工程技術研究中心，河北 邢臺 054001)

酸棗(Ziziphusjujubavar.spinosa)又名野棗、山棗、棘，鼠李科(Rhamnaceae)棗屬(Zizyphus)落葉灌木或小喬木，偶見高大喬木，在我國廣泛分布，在太行山區為常見物種，可生在荒坡、溝邊、路旁、沙礫、石縫中，在水分、營養物質豐富的地方生長更盛。酸棗產業已成為邢臺地區山區縣市的主要產業，作為發展國民經濟、改善生態環境、豐富人民生活的重要戰略措施在各級政府和不同組織機構得以貫徹實施。目前對酸棗的開發利用是基于已有酸棗種質資源開展的[1-3]，有關生理生化研究多是在全株或組織器官水平上進行[4-6]。在細胞水平、細胞器水平甚至分子水平上對酸棗加以改良或深入的生理、生化研究是酸棗產業發展和科學研究的必然要求和重要發展趨勢。原生質體由于去除了細胞壁，質膜暴露在外，易于攝取細胞器、病毒、細菌和核酸，可以進行顯微注射、細胞融合[7]，為細胞轉化、品種改良、雜交品系建立以及進一步探索細胞生命活動特性有非常重要的意義。相較于其它材料，由于種子下胚軸和幼根材料易得、分化程度低、易于誘導分化、細胞壁薄，成為制備原生質體的理想材料，世界上第一個獲得的原生質體就是以幼根材料制備的[8-9]。通過酸棗幼根原生質體制備方法探索，為酸棗育種、基因工程的開展和細胞生理研究奠定基礎。

圖1 酸棗種子的處理和萌發過程

表1 不同酶解液成分對酸棗幼根原生質體制備的影響

1 材料和方法

1.1 試驗材料、藥品

“邢州10號”酸棗種子，由河北邢州棗業有限公司提供。

纖維素酶R-10、纖維素酶RS、果膠酶均為Japan Yakult 公司產品，甘露醇為國產分析純試劑。

1.2 酸棗萌發幼根

選擇籽粒飽滿、無機械損傷的種子，在75%酒精中浸泡5 s進行表面消毒，用無菌水洗凈[10]，然后，置于底部鋪有4～6層紗布的培養皿中，每皿10～15粒種子，將紗布用無菌水打濕，種子上面覆蓋一層用無菌水濕潤的濾紙。在培養過程中，保持濾紙紗布濕潤但不被水淹沒。用鋁箔紙包裹，置于25 ℃恒溫培養箱中。

2 試驗結果與分析

2.1 酸棗幼根的預處理

將酸棗種子培養5～8 d，待幼根生長到1 cm左右時(圖1)，切取幼根根尖下部包括分生區的根段，用濾紙吸干表面水分，在載玻片上，用刀片切成長1 mm左右的切段，放入EP管中。刀片力求鋒利，避免在切割時擠碾壓破細胞。在EP管中事先加入1 mL含0.7 mol·L-1甘露醇、pH 5.5～6.0的緩沖液，于黑暗處靜置1 h進行質壁分離預處理。

2.2 預試驗

將幼根切塊質壁分離處理后，加入果膠酶、纖維素酶R-10、纖維素酶RS，制成不同濃度組合的酶解液(表1)，輕搖使之混勻，置于28 ℃恒溫水浴中，酶解期間每0.5 h在顯微鏡下觀察原生質體狀況，直到原生質體的數目不再增加，此時可認為酶解完成。試驗結果顯示，果膠酶濃度從0.5%增加到1%時，原生質體產量明顯增多，但濃度增加到2%時，原生質體產量沒有明顯增加，細胞碎片開始增加；纖維素酶R-10的濃度從1%增加到3%時，原生質體產量不斷增加，濃度由3%增加到4%時，原生質體產量沒有明顯增加；纖維素酶RS的濃度從1%增加到3%時，原生質體產量不斷增加，濃度由3%增加到4%時，原生質體產量沒有明顯增加(表1)。試驗結果表明，果膠酶的最適濃度為1%左右、纖維素酶R-10的最適濃度為4%左右、纖維素酶RS的最適濃度在3%左右。

2.3 正交試驗

根據預試驗結果，繼續采用三因素三水平的正交試驗法進行深入研究。三因素為果膠酶、纖維素酶R-10、纖維素酶RS。每個因素設三個水平，分別為果膠酶濃度分別為0.5%、1%、1.5%，纖維素酶R-10的濃度分別為3%、4%、5%，纖維素酶RS的濃度分別為1%、2%、3%。酶解完成時，將酶解液放入臺式低溫離心機，4 ℃、3 000 r·min-1離心5 min，棄去上清液，加入1 mL緩沖液，重復離心洗滌3次，置于顯微鏡下觀察原生質體狀況。根據離心后原生質體產量、所需酶解時間、細胞碎片數三個指標確定最適酶濃度組合，根據L9(34)正交試驗確定最適酶濃度組合為1%果膠酶、4%纖維素酶R-10、3%纖維素酶RS(表2)。

表2 不同濃度酶解液制備酸棗幼根原生質體的正交試驗

注：箭頭所指為原生質體。圖2 顯微鏡下酸棗幼根細胞原生質體(10倍)

3 討 論

3.1 材料的選擇和預處理

植物幼根根尖包括根冠、分生區、伸長區、成熟區四個部分，分生區細胞分化程度低，細胞小而核相對大、質濃，尤為重要的是細胞壁薄，主要成分為果膠質和纖維素，不含木質素。而根冠、伸長區、成熟區的細胞有一定程度的分化，小液泡融合，體積增大，細胞質所占比例降低[11]。因此，從酶解的便利性和原生質體的可實用性上來看，分生區細胞是最為理想的原生質體制備材料。在本研究中，格外注意截取的幼根長度，不可過長，盡量少截取伸長區，避免截取到成熟區，而根冠部分由于與分生區部分難以分清，細胞數目不多，在試驗中未予重視。

大量研究表明，進行質壁分離處理可擴大細胞壁內表面積，從而增加水解酶的接觸面[12]，可切斷胞間連絲[13]，提高酶解效率[14-16]。在本研究中，在酶解處理前，對切碎的幼根進行了質壁分離預處理，在其后的酶解處理中，對質壁分離效果未做進一步研究。

3.2 水解酶濃度的確定

果膠酶可降解連接細胞壁的中膠層，使細胞從植物組織上游離出來；纖維素酶降解細胞壁而使原生質體釋放。因此，一般采用纖維素酶和果膠酶的混合液來降解細胞壁制備原生質體。在一定范圍內，酶的作用效果隨濃度的增加而增加，當酶濃度超過一定范圍時，導致細胞碎片增多，酶解效果下降[16]，所以選擇合適的酶濃度對于原生質體的制備很重要。本研究首先結合文獻報道[7,10,17]，通過預試驗初步確定酶最適濃度范圍，再用正交法高效、準確地確定酶的最適濃度。

在一定范圍內，原生質體分離的速度隨酶解液濃度的增加而增加，但當酶濃度過高時，會使細胞碎片增多而影響原生質體的質量(表1、表2)。預試驗中，當果膠酶濃度從0.5%增加到1%時，原生質體產量明顯增多，但當濃度增加到2%時，原生質體產量沒有明顯增加，細胞碎片開始增加(表1)。綜上，在28 ℃水浴條件下，在含0.7 M甘露醇、pH 5.5～6.0的緩沖液中質壁分離預處理1 h，當加入水解酶的組合為1%果膠酶+4%纖維素酶R-10+3%纖維素酶RS時，制得的酸棗幼根原生質體產量較高、細胞碎片較少、速度快，為制備酸棗幼根原生質體較合適的條件。