食管鱗癌免疫相關基因鑒定及miR-6806-5p靶標預測

劉志偉，李新陽，王子明，任 婧，王新帥

食管癌作為消化系統惡性腫瘤之一，死亡率高，嚴重威脅人類的健康[1]。《2018年全球癌癥統計》對全世界范圍內185個國家36種癌癥的發病率及死亡率的估計顯示，2018年食管癌新發572 034例，其發病率和病死率分別在全球惡性腫瘤中居第七位和第六位[2]。同時中國食管癌新發及死亡病例約占全球病例的一半，《2015年中國惡性腫瘤流行情況分析》顯示我國食管癌新發24.6萬例，死亡18.8萬例，其發病率和病死率分別在中國惡性腫瘤中居第七位和第四位[3]。由于食管癌早期無明顯癥狀，大多數患者確診時已是晚期，無手術根治切除的機會，傳統放化療尚不能明顯提高患者遠期生存率，近年來免疫治療的興起使多種癌癥患者受益，同時也為食管癌精準治療提供了一種新的治療方式。基于此，進一步探明更多影響食管癌免疫相關基因顯得尤為必要。因此，本研究在轉錄組水平上通過對比分析食管鱗癌與正常組織的基因表達差異性，探尋食管鱗癌免疫相關基因，并驗證其有效性，為食管鱗癌免疫治療提供理論依據。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 數據下載及預處理研究采用Rstduio(3.6.3版本)下載函數，從GEO數據庫獲得GSE75241基因表達矩陣及平臺信息GPL5175[HuEx-1_0-st] Affymetrix Human Exon 1.0 ST Array[transcript (gene) version]。基因表達矩陣GSE75241共納入15例食管鱗癌組織樣本及15例癌旁組織樣本，借助標準化函數降低數據間的差異性，使基因表達數據具有較好的一致性，基于平臺信息將探針名轉化為基因名以用于下一步分析。

1.2 免疫相關基因鑒定基于Rstduio的相關軟件包Limma(3.42.2版本)綜合對比分析食管鱗癌組織與癌旁組織的基因表達矩陣，得到差異分析矩陣。差異基因定義為FDR<0.01及|logFC|≥1。Ggplot2包(3.3.0版本)用于繪制火山圖和可視化差異分析結果。本研究從在線分析免疫相關基因的數據庫Immport下載得到2 498個免疫相關基因，進一步結合分析差異基因，確定具有顯著差異性的免疫相關基因。

1.3 PPI網絡構建及關鍵免疫相關基因確定STRING(https://string-db.org/)數據庫用于評估蛋白質的相互作用(protein-protein interaction，PPI)和網絡內基因的量化關系。關鍵基因(key genes)是指與網絡內其他基因高度相關，并對整個網絡有重要影響的基因。關鍵免疫相關基因依據基因之間的關聯度(degree)篩選分析。

1.4 關鍵免疫相關基因分析驗證及miRNA預測GEPIA(http://gepia.cancer-pku.cn/)數據庫可以根據腫瘤類型對比分析腫瘤與正常組織中關鍵基因的差異表達情況，并用箱線圖可視化驗證。基于Kaplan Meier-plotter(http://kmplot.com/analysis/)數據庫驗證關鍵基因對生存預后的影響。MiRWalk數據庫(http://mirwalk.umm.uni-heidelberg.de/)是一個多物種綜合性的miRNA靶基因數據庫，選擇靶位點在3’-UTR區域相關性>95%的miRNA用于預測關鍵免疫相關基因的miRNA。

1.5 統計學方法本研究統計學計算及分析采用

Rstduio(3.6.3版本)和相關軟件包，以P<0.05為有統計學意義，FDR(false discovery rate)指調整后的P值。

2 結果

2.1 數據下載及預處理本研究通過R下載函數獲得GSE75241基因表達矩陣及GPL5175平臺信息。通過標準化及探針轉化，得到17 324個基因和30例食管組織樣本(15例食管鱗癌組織和15例癌旁組織)構成的基因表達矩陣。

2.2 免疫相關基因鑒定基于Limma包差異分析17 324個基因，得到基因的差異表達矩陣。以“FDR<0.01及|logFC|≥1”為篩選條件，共得到1 437個顯著差異表達基因(841個上調差異基因和596個下調差異基因)，如圖1所示，紅點代表841個上調基因，綠點代表596個下調基因。進一步將1 437個差異基因與2 498個免疫相關基因結合分析，發現差異基因中存在169個顯著差異的免疫相關基因(130個上調、39個下調)，如圖2所示。

圖1 差異基因火山圖

圖2 免疫相關基因鑒定

2.3 PPI網絡構建及關鍵免疫相關基因確定本研究將130個上調和39個下調免疫相關基因上傳至STRING在線數據庫得到基因之間的量化關系。基于基因之間的量化關系，通過Cytoscape軟件繪制上調及下調免疫相關基因的PPI網絡并行可視化分析。選取上調免疫相關基因PPI網絡基因關聯度≥65的基因作為關鍵免疫相關基因，選取下調免疫相關基因PPI網絡基因關聯度≥7的基因作為關鍵免疫相關基因。如圖3A和3B所示，上調關鍵免疫相關基因為IL-6(白介素6)、CXCL8(白介素8)，下調關鍵免疫相關基因為IL-18(白介素18)。

A：上調免疫相關基因PPI網絡；B：下調免疫相關基因PPI網絡。圖3 免疫相關基因PPI網絡

2.4 關鍵免疫相關基因分析驗證及miRNA預測本研究基于GEPIA在線數據庫分析IL-6、CXCL8和IL-18在食管癌及正常食管組織中的基因表達水平。如圖4所示，對比正常食管組織，IL-6和CXCL8在食管癌組織內高表達，而IL-18在食管癌組織內低表達。進一步將IL-6、CXCL8和IL-18上傳至Kaplan Meier-plotter數據庫分析基因表達水平對食管癌患者總生存期(overall survival,OS)的影響，如圖5所示，IL-6和CXCL8高表達與食管癌患者較短的總生存期相關(P<0.05)，而IL-18表達與食管癌患者生存期無相關性(P>0.05)。基于miRWalk數據庫獲得與IL-6、CXCL8和IL-18有關的miRNA，得到與IL-6顯著相關miRNA 75個，與CXCL8顯著相關miRNA 206個，與IL-18顯著相關miRNA 199個，通過繪制維恩圖發現miR-6806-5p共同靶向IL-6、CXCL8和IL-18(圖6)。

紅色：食管癌組織; 黑色：正常食管組織。圖4 關鍵免疫相關基因在食管癌和正常組織中差異表達

圖5 關鍵免疫相關基因OS評估

圖6 免疫相關基因miRNA靶標預測

3 討論

食管癌是世界第七大常見癌癥，中國食管癌發病率居世界首位。免疫治療通過刺激免疫系統消滅腫瘤，相比于傳統放化療，其藥物毒性作用少，已使越來越多的患者受益[4]。目前，免疫治療在食管癌中的研究逐漸展開，挖掘食管癌免疫相關基因，對于食管癌免疫治療尤為必要。

本研究通過差異對比分析食管鱗癌與正常組織的基因表達量，鑒定出與免疫基因顯著相關的差異基因169個，通過分析免疫相關基因PPI網絡，確定關鍵免疫相關基因為IL-6、CXCL8(上調)和IL-18(下調)。對比分析正常食管組織，IL-6和CXCL8在食管癌組織中高表達，而IL-18在食管癌組織中低表達(圖4)，與差異分析結果一致。生存分析顯示IL-6和CXCL8的高表達與患者較短總生存期相關(P<0.05)，IL-18表達雖然與食管癌免疫相關，但與患者生存期無顯著相關性(P>0.05)。綜合分析IL-6、CXCL8和IL-18相關miRNA，發現miR-6806-5p共同靶向IL-6、CXCL8和IL-18，提示miR-6806-5p可能共同調控IL-6、CXCL8和IL-18的表達。

IL-6是一種多功能促炎細胞因子[5]，在惡性腫瘤的發病和發展過程中起重要作用[6]。已證實，IL-6在黑色素瘤、結直腸癌、卵巢癌等多種癌癥中高表達[7-9]，且與癌癥患者生存率呈負相關[10]。IL-6主要通過JAK2-STAT3、Ras-MAPK和PI3K-Akt信號通路促進腫瘤細胞擴增及新生血管的生成[6，11-12]。腫瘤免疫逃逸與IL-6調節多種免疫細胞(T細胞、樹突狀細胞及巨噬細胞)有關[13-14]。CXCL8是一種由多種腫瘤細胞產生能吸引髓系白細胞的促炎性趨化因子[15]。CXCL8同樣在多種腫瘤細胞中高表達，如乳腺癌、胃癌、前列腺癌等。且血清白介素8的高水平與疾病進展有關[16]。CXCL8由腫瘤細胞通過旁分泌或自分泌產生后，與趨化性受體CXCR1或CXCR2相互作用，可以改變腫瘤微環境內免疫細胞的構成或促進致癌信號、血管生成及多藥耐藥[17]。最新研究表明，腫瘤細胞分泌CXCL8可以促進髓系來源的抑制細胞浸潤，進一步導致T免疫細胞受抑制引起腫瘤免疫逃逸[18]。IL-18屬于白介素1家族，是一種免疫刺激細胞因子[19]。由活化的免疫細胞(單核細胞、巨噬細胞、自然殺傷細胞等)產生的IL-18可以刺激Th1或自然殺傷細胞產生IFN-γ，促進淋巴細胞增殖增強體內免疫系統。各種腫瘤細胞都會產生IL-18誘導癌細胞侵襲、轉移和增殖[20]。miRNA靶標預測發現miR-6806-5p共同調控IL-6、CXCL8和IL-18，目前miR-6806-5p的生物學功能尚不清楚，但是其靶向性可能作為研究食管癌免疫治療的一個新靶標。

綜上所述，本研究基于綜合數據分析，對比食管鱗癌與正常食管組織的基因表達譜，鑒定與食管癌顯著相關的免疫基因，表明IL-6、CXCL8和IL-18通過影響免疫細胞，可能會導致腫瘤免疫逃逸的發生，并進一步預測出共同調控IL-6、CXCL8和IL-18的miRNA(miR-6806-5p)，為食管鱗癌免疫治療提供一定的理論依據。