miRNAs與Wnt通路調節食管癌的發生

陳蒙蒙，金瑋娜，彭天嬌，姚 俊

食管癌(esophageal cancer，EC)是消化道最具侵襲性的惡性腫瘤之一，其發病率在所有惡性腫瘤中排名第七，死亡率位居所有癌癥中第六[1]。中國是EC發病率最高的國家之一，2015年我國EC患者預估有47.7萬人，同年死亡人數有37.5萬人[2]。目前EC的5 a生存率為15%～25%，但早期EC的5 a生存率可高達80%[3]，盡管提倡早發現、早診斷、早治療，然而大多數EC患者在被診斷和治療時已經是晚期，這是EC預后差的主要原因。雖然內鏡檢查是檢測早期EC的有效方法，并且可以降低死亡率[4]，但高昂的成本和侵襲性限制其作為早期廣泛篩查工具[5]。因此,尋找無創性早期檢測方法無疑是提高EC早期診斷率和改善預后的有效途徑。

MicroRNA(miRNA)是一類存在于真核生物體內、短小的、保守的非編碼RNA，在基因表達調控和mRNA轉錄及翻譯中起到特定的作用，包括細胞分化、增殖及凋亡等生物學過程[6]。有研究證實，許多miRNAs在腫瘤中異常表達，并以原癌基因或抑癌基因的形式影響腫瘤的啟動和進展[7]。臨床上，越來越多的miRNAs被用作腫瘤的診斷、監測預后、評價療效等。因此研究miRNA的下游通路以及作用方式成為熱點。

miRNA在食管癌發生發展中的作用與Wnt/β-catenin信號通路密切相關[8]。Wnt信號通路是1982年與原癌基因Int1(也稱為Wnt1)共同發現的一種重要的細胞外信號通路[9]。這條信號通路涉及多種發育過程，如細胞生長、分化、凋亡、遷移、個體發育、遺傳穩定性、干細胞的自我更新、組織內穩態的維持、組織再生和腫瘤發生等多種生物學過程[10-11]。

Wnt信號通路包括兩條不同的細胞內信號通路，經典的(Wnt1、Wnt2、Wnt3、Wnt3a、Wnt7和Wnt8等Wnt蛋白)和非經典的(Wnt4、Wnt5a、Wnt5b和Wnt11等Wnt蛋白)。經典的Wnts通過β-catenin轉導信號，從而激活β-catenin/Tcf/Lef靶基因的轉錄[12-13]，非經典Wnts途徑又分為Wnt/Ca2+途徑和Wnt /平面細胞極性(Pane cell polarity，PCP)途徑。而非經典的Wnts與Wnt平面細胞極性通路、Wnt-JNK信號通路、Wnt/Ror受體通路、Wnt-GSK3MT通路、Wnt-aPKC通路、Wnt-Ryk通路和Wnt-mTor通路等的激活有關[14]。Wnt信號通路應保持在正常水平，以發揮正常的生理功能。然而，大量研究表明Wnt通路在許多癌癥中被激活[15]。因此，確定遺傳因素和生物標記物，對于預測Wnt途徑調節劑治療的療效、診斷和判斷腫瘤的預后，以及開發新的治療方法具有重要意義。為了探討miRNAs通過Wnt途徑在EC進展中的不同作用，本文綜述所有已報道的與Wnt途徑相關的miRNAs。

1 miRNAs通過Wnt通路調節食管癌細胞的增殖、侵襲和轉移

Ma J的研究表明，miR-4261在食管鱗癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)組織中的表達水平明顯高于正常組織，且與MEG3在ESCC組織中的表達呈負相關，mRNA MEG3在ESCC組織中表達下調，并與腫瘤進展和預后不良有關。此外，體內外實驗表明miR-4261是MEG3的靶點，MEG3可以直接調控miR-4261的表達、上調DKK2和阻斷Wnt/β-catenin信號通路，抑制細胞增殖、遷移和侵襲[16]。

Qiao G等用RT-qPCR方法檢測50例配對的ESCC組織和非腫瘤組織，證實miR-106b-3p在ESCC組織中表達上調，而ZNRF3在ESCC中下調。ZNRF3是Wnt/β-catenin信號轉導的負調控因子，被認為是miR-106b-3p的直接靶標。實驗結果表明，miR-106b-3p通過下調ZNRF3和通過Wnt/β-catenin信號通路誘導ESCC細胞的EMT，促進細胞增殖和侵襲[17]。

有研究發現miR-301a在EC細胞中表達上調，熒光素酶報告分析證實Wnt1是miR-301a的靶基因，miR-301a通過靶向Wnt1阻斷Wnt/β-catenin信號通路和EMT的逆轉，抑制食管癌細胞增殖和遷移,增強放射敏感性[18]。

miRNA let-7a也是與人類惡性腫瘤有關的miRNAs之一[19]。研究表明，與癌旁組織相比，腫瘤中let-7a的抑制與ESCC的侵襲、轉移和不良預后密切相關。Lin28是一種RNA結合蛋白，在信號轉導中起關鍵作用，調節Let-7a和Wnt信號通路下游基因的表達[20-21]。Wnt/β-catenin/lin28信號轉導誘導EMT，并通過消除let-7a而促進ESCC的侵襲、轉移和不良預后[22]。

根據芯片數據的分析和ESCC活檢的驗證，與匹配的鄰近正常組織相比，ESCC組織中miR-30a-3p/5p下調，且與Wnt信號的激活相關。miR-30a-3p/5p直接靶向Wnt2和Fzd2的3’-UTR并分別抑制它們的表達，進而調節了EC細胞增殖[23]。

miR-455-3p在ESCC和多種癌癥中上調，根據腫瘤類型的不同而起到促進或抑制腫瘤的作用[24]。Liu A等證明miR-455-3p在ESCC中明顯上調，并與患者的總生存期和疾病生存期較短相關，同時證實了miR-455-3p的沉默降低了β-catenin和TGF-β/Smad信號通路下游基因在各自途徑中的表達水平，表明miR-455-3p在ESCC中激活Wnt/β-catenin和β-smad途徑，并促進EC細胞轉移和侵襲[25]。先前的研究表明miR-200b是ESCC的侵襲性抑制因子[26]， Zhang HF等驗證了miR-200b主要誘導ESCC細胞G2期阻滯、凋亡，抑制細胞生長和克隆形成潛能，介導其在ESCC中的腫瘤抑制作用。CDK2和PAF(一種有效的癌蛋白)被鑒定為miR-200b靶點，并通過抑制Wnt/β-catenin信號轉導抑制細胞生長，顯示miR-200b是ESCC中的治療靶點[27]。

Xu Y發現EC標本中β-catenin的水平顯著升高，而miR-214的水平顯著降低。EC標本中β-catenin和miR-214水平呈負相關。miR-214與β-catenin mRNA的3’-非翻譯區結合抑制了β-catenin mRNA的蛋白質翻譯，直接促進腫瘤的生長和轉移，從而證明miR-214的下調通過激活Wnt/β-catenin通路來促進EC細胞生長和侵襲[28]。

研究表明，HPV-16感染可能是EC的重要危險因素[29]。Zang B等發現HPV E6通過直接下調TLE1、GSK3β和sFRP4在內的多個調節因子而激活Wnt/β-catenin通路，miR-125b的過表達恢復了這些蛋白的表達水平。在HPV-16 E6陽性EC組織中miR-125b的表達較低，并與HPV-16 E6 mRNA水平呈負相關。結果表明，HPV16 E6通過下調miR-125b促進EC發生，這一機制參與了Wnt/β-catenin信號通路的激活[30]。

食管癌細胞的增殖、侵襲和轉移是食管癌惡性程度高的原因之一，上述多種miRNA的異常表達激活或抑制Wnt/β-catenin信號轉導通路，靶向不同的靶點，不同程度上調控了食管癌細胞的增殖、侵襲和轉移。

2 miRNAs通過Wnt通路調節食管癌的放射敏感性

放射治療是晚期EC的主要治療方式之一。一項研究表明，局部進展期EC的根治性同步放療和化療比單純放療具有更大的生存優勢，但局部復發率和遠處轉移率仍然很高[31]。放射治療耐藥一直被認為是局部腫瘤復發或轉移的最重要原因。先前的研究表明miR-301a是放射敏感性miRNAs異常分布的候選分子，并與ESCC放射敏感性有關[32]。miR-301a在EC細胞系中下調，而其靶基因Wnt上調，表明Wnt/β-catenin信號通路在食管癌細胞放射抗性中具有重要作用。Su H等研究證明轉染miR-301a的放射抗性ESCC細胞KYSE-150R的增殖速率降低，放射敏感性和遷移率增加，雙熒光素酶報告分析表明，Wnt1是miR-301a的靶基因，證明miR-301a可能是一種新型的放射敏感性相關miRNA，可用于EC放射抗性治療策略[18]。

Xie C等在功能上證明了抑制miR-1275的表達促進了EMT，增加ESCC細胞KYSE-150的放射抗性，從機制上證明了miR-1275直接靶向Wnt1，使EC細胞中的Wnt/β-catenin信號通路失活。此外，Wnt1缺失通過抑制EMT，抵消了miR-1275抑制KYSE-150細胞輻射抗性的促進作用。他們的研究結果提示，miR-1275通過靶向Wnt1，抑制Wnt/β-catenin信號通路來抑制EC細胞的放射敏感性，為克服EC患者的放射抵抗提供了新的治療途徑[33]。

3 miRNAs通過Wnt通路調節食管癌細胞的自噬

細胞自噬是真核生物中對細胞內物質進行周轉的重要過程，主要通過降解蛋白和受損細胞器來維持細胞內代謝穩態[34-35]。ATP形式的能量可以激活AMP激酶并驅動自噬。自噬可以通過一些抗癌療法(如化療、放療和靶向治療)來誘導，以促進癌細胞從應激誘導的損傷中存活。越來越多的證據突出了自噬在癌癥中的重要作用，因為激活的自噬導致癌細胞的生存或死亡[36]；另一方面，也有報道稱抗癌治療可以誘導自噬細胞死亡。因此，自噬對癌癥發展的貢獻仍然存在爭議。

miR-638是一種潛在的癌基因，促進致瘤性，miR-638的過表達促進饑餓和雷帕霉素誘導自噬[37]。DACT3是Wnt/β-catenin信號轉導的負調節因子，在多種惡性腫瘤中被轉錄抑制[38]。Ren Y等證明了在ESCC標本中miR-638表達增強而DACT3表達減弱，miR-638可能負調節DACT3的表達，促進自噬以及惡性腫瘤的發生，自噬相關的miR-638-DACT3-Wnt/β-catenin軸可能是癌癥治療干預的一個有吸引力的靶點[39]。

4 miRNAs通過Wnt通路調節食管癌的化療耐藥

臨床上食管癌常用的化療藥物包括順鉑、5-FU和多西他賽等，但研究顯示單藥在食管癌治療中效果欠佳[40]，所以臨床上廣泛采用聯合用藥,腫瘤細胞對化療藥物產生耐藥常常最終導致化療失敗[41]。因此,在分子水平上闡明腫瘤細胞的耐藥機制對于新藥研發及提高化療效果具有重要意義。

Liu A等通過采用耐化療的ESCC患者衍生的異種移植模型，成功地富集了耐化療的ESCC細胞，在耐化療的食管癌細胞和正常食管癌細胞中進行了miRNA分析，發現miR-455-3p在耐化療的食管癌細胞中的表達明顯高于正常食管癌細胞，抑制miR-455-3p可使ESCC細胞增敏，miR-455-3p作為負調控因子同時激活Wnt/β-catenin和TGF-β/Smad信號通路參與食管癌的化療耐藥[25]。

Wang Y等建立了一系列耐5-FU的EC細胞系，通過RT-qPCR分析它們的miRNAs差異表達。在一組5-FU耐藥的EC細胞(OE19、OE33、PT1590和LN1590)中，miR-221在所有耐藥變異體中過表達，miR-221的表達增加導致DKK2的表達減少，進一步抑制DKK2介導的Wnt/β-catenin信號通路，表明miR-221誘導的化學耐藥是通過Wnt/β-catenin信號通路介導的[42]。

5 miRNAs通過Wnt通路促進食管癌的發生

Wnt/β-catenin信號通路是控制干細胞特征并促進腫瘤發生的主要分子途徑[43]。Ge C等將Eca109/miR-942或Eca109/載體細胞皮下移植到小鼠體內，Eca109/miR-942細胞形成的腫瘤在大小和重量上都比載體控制細胞形成的腫瘤大。相反當使用antiagomir-942抑制miR-942的內源性表達時，腫瘤明顯比對照細胞形成的腫瘤更小更輕。更重要的是，當植入1×102個細胞時，只有Eca109/miR-942細胞形成腫瘤[44]。而且結果證實miR-942的過度表達可通過抑制sFRP4、GSK3β和TLE1等因子，上調Wnt/β-catenin信號轉導活性，通過促進食管腫瘤干細胞樣特征進而促進食管癌的發生，并可能與腫瘤不良預后有關。揭示了一種新的分子機制來解釋Wnt/β-catenin通路的組成性激活是如何促進腫瘤發生的，并提示miR-942可能作為監測、篩查食管癌發生的潛在標志物。

近年來食管癌發病率仍很高，總體治療效果仍欠佳，復發轉移率仍較高。miRNA通過不同的機制調節基因表達，通過與其他細胞大分子相互作用，激活或抑制Wnt信號通路，從而提供食管癌惡性轉化的信號。Wnt通路相關的miRNAs在食管癌中受到不同程度的調控，調節食管癌細胞的增殖、侵襲和轉移，調節食管癌細胞的自噬和細胞表型，調節食管癌的化療耐藥，調節食管癌的放射敏感性，促進食管癌細胞干細胞特征從而促進食管癌的發生等(見表1)。Wnt信號通路與miRNA的相互作用，在腫瘤的發生發展中起著重要的作用。這一結果證明miRNA-Wnt信號通路可作為腫瘤治療的潛在靶點和預測治療反應的診斷指標。盡管人們在尋找新的治療方式方面做了大量的努力，但對Wnt通路在食管癌中靶向的分子機制仍存在一些爭議，這個潛在機制有待于進一步研究，以提高療效和開發聯合療法。

表1 食管癌中與Wnt通路相關的miRNAs