鹽生植物鹽爪爪液泡膜鈉氫反向運輸載體基因(KfNHX1)遺傳轉化擬南芥的耐鹽性鑒定

銀芳柳，毛曉菲，曾幼玲

(新疆大學生命科學與技術學院/新疆生物資源基因工程重點實驗室,烏魯木齊 830046)

0 引 言

【研究意義】鹽脅迫是影響作物產量的主要因素之一。為了應對鹽脅迫，植物已進化出多種生理和分子機制，如滲透調節、抗氧化防御以及離子轉運和區隔化機制等[1]。其中離子穩態對于維持植物細胞的正常生理代謝非常重要[2]。研究離子穩態的關鍵基因對于植物耐鹽性有重要意義。【前人研究進展】Na+/H+反向轉運蛋白(NHX1和SOS1)是一類在離子穩態中起重要作用的膜蛋白，屬于單價陽離子/H+反向轉運體CPA1家族成員[2]。SOS1位于質膜上，在質外體中排出Na+[3]；而NHX1位于液泡膜中，將Na+泵入液泡中來降低胞質中的Na+濃度[4]。通過調節胞間離子的跨膜轉運來保持適當的離子濃度，從而避免Na+在胞質中的毒害。植物液泡膜Na+/H+反向運輸載體基因(NHX1)已經從多種植物中克隆，如擬南芥(Arabidopsisthaliana)[5]、鹽地堿蓬(Suaedasalsa)[6]、甜菜(Betavulgaris)[7]、海馬齒(Sesuviumportulacastrum)[8]，其過表達都能夠增強轉基因擬南芥的鹽脅迫耐受性。【本研究切入點】藜科鹽生灌木鹽爪爪在西北鹽堿沙漠地區廣布，其莖葉肉質化，具有極強的耐鹽能力[9]。研究是基于已克隆的鹽爪爪KfNHX1基因[10]，通過遺傳轉化擬南芥對其耐鹽性進行分析。【擬解決的關鍵問題】研究農桿菌介導的轉鹽爪爪KfNHX1基因擬南芥的耐鹽性，通過基因組PCR和RT-PCR鑒定轉基因株系，在鹽脅迫下對轉鹽爪爪KfNHX1擬南芥的萌發率、根長、離子含量及表型分析，為鹽爪爪KfNHX1基因的耐鹽分子育種奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材 料

野生型擬南芥(Col)和轉基因擬南芥種子在1/2 MS(Murashige and Skoog medium)培養基上生長1周，移栽至花土(腐殖土∶蛭石∶珍珠巖= 3∶1∶1)中。培養條件：溫度為22℃，相對濕度為40%～60%，光照周期為16 h光照/8 h黑暗。

BamH I、SalI等限制性核酸內切酶、ExTaq、DNA polymerase、dNTP Mixture、DNA Marker、Oligo (dT)18Primer、Reverse Transcriptase M-MLV (RNase H) 和Ribonuclease Inhibitor購自大連寶生物技術有限公司；植物基因組提取試劑盒、植物總RNA提取試劑盒、質粒小提試劑盒購自北京天根生化科技有限公司；引物由上海生工生物工程股份有限公司合成；其余常用試劑為國產分析純試劑。

1.2 方 法

1.2.1 植物表達載體的構建和農桿菌介導的遺傳轉化

將KfNHX1(AY825250)的開放閱讀框(ORF)克隆到pCAMBIA1301質粒的35S啟動子和PolyA信號之間(BamH I、SalI)。將成功構建的質粒轉化農桿菌EHA105。采用花序浸染法浸染擬南芥，收獲種子。35 mg/L潮霉素篩選轉基因種子，篩選T2代符合3∶1的轉基因株系，T3代純合株系用于后續實驗。

1.2.2 轉KfNHX1基因擬南芥的PCR及RT-PCR鑒定

根據試劑盒說明書分別提取植物樣本的基因組和總RNA。通過KfNHX1全長編碼序列ORF的引物P1(5'-TCAGGATCCATGTGGTCACAGTTAAGC-3')和P2(5'-GGAGTCGACCTATGTTCTGTCTAGCAAATTGT-3')擴增擬南芥基因組中的KfNHX1；使用KfNHX1部分編碼序列引物P3(5'-ATAATCAGTTTACAAGGTCAGGGC-3')和P4(5'-TAATAGTGGACGGTGTGAGTAGGT-3')進行RT-PCR擴增擬南芥cDNA中的KfNHX1。

1.2.3 NaCl和ABA脅迫處理下轉基因擬南芥耐性

野生型和T3代轉基因擬南芥的純合種子進行表面滅菌并在4℃ 放置2 d，于植物光照培養箱中生長，培養條件同上。

1.2.3.1 種子萌發率

將野生型和轉基因的擬南芥種子播種在含有0、50、75、100、125、150 mM NaCl和1 μM ABA的1/2 MS培養基中，當種子出現子葉時記錄為萌發，每天的萌發率為發芽種子數與種子總數之比。每處理共120粒種子用于測定萌發率。

1.2.3.2 苗期根長

將野生型和轉基因擬南芥幼苗(5日齡)轉移至含有0、120 mM NaCl和10、15 μM ABA的1/2 MS培養基上，3個生物學重復，于植物光照培養室中豎直培養10 d后拍照，采用ImageJ軟件測定根長。

1.2.3.3 成苗的脅迫表型及Na+和K+含量

用逐漸增加到200 mM NaCl澆灌生長5周的轉基因擬南芥，鹽脅迫處理至第15 d拍照。在脅迫第7 d時取擬南芥葉片，置于60℃的烘箱中烘干至恒重。用HNO3處理樣品，煮沸至酸液揮發盡，用超純水定容。使用原子吸收分光光度計(Z-8000，Hitachi，Tokyo)測定Na+和K+含量，每個處理3個生物學重復。

1.3 數據處理

數據表示為平均值±SE(n=3)并且進行單因素方差分析(ANOVA)。進行多重比較以確定組間和組內之間的顯著差異。顯著性水平為P< 0.05(*)；P< 0.01(**)；P< 0.001(***)。

2 結果與分析

2.1 轉KfNHX1基因擬南芥的遺傳轉化和鑒定

研究表明，將KfNHX1編碼序列構建至具有潮霉素抗性標記的植物雙元表達載體pCAMBIA1301中。根癌農桿菌介導花序浸染法轉化擬南芥。使用潮霉素抗性(HPT)篩選T2代具有3∶1的轉基因株系，進而獲得T3代純合株系。對轉基因純合株系進行分子檢測。通過基因組PCR和RT-PCR檢測，均在轉基因株系中擴增出相應的目的條帶，KfNHX1已整合到擬南芥的基因組中，并在RNA水平上轉錄表達。圖1,圖2

圖 1 pCAMBIA1301-CaMV35S-KfNHX1的構建圖譜Fig.1 Physical map of pCAMBIA1301-CaMV35S-KfNHX1 construct

注：A、B：分別為轉KfNHX1基因擬南芥中的基因組PCR和RT-PCR分析；M：DL2000 Marker；1、6：陰性對照；2、7：陽性對照；3、8：野生型；4、5、9、10：轉基因株系KN6和KN14

2.2 鹽和ABA脅迫條件下轉KfNHX1基因擬南芥的種子萌發

研究表明，野生型與T3代純合轉基因擬南芥的種子分別在不同濃度(0、50、75、100、125、150 mM)的NaCl以及外源施加ABA(1 μM ABA)處理6 d后測定萌發率。50 mM NaCl和對照條件下野生型和轉基因株系種子萌發率沒有顯著差異，而在75至125 mM NaCl和1 μM ABA處理后，野生型種子萌發率僅約40%，而KN6株系超過80%。相較于野生型，轉基因株系在種子萌發率方面表現對鹽和ABA的抗性。圖3，圖4

注：A、B：分別為在0、50、75、100、125、150 mM NaCl脅迫下WT和KN6的萌發表型和萌發率

注：A、B：分別為ABA處理下WT和KN6的萌發表型和萌發率

2.3 鹽脅迫和ABA處理下轉KfNHX1基因擬南芥的抗性

研究表明，轉基因植株的生長明顯優于野生型，而不處理的對照擬南芥的生長無差異，KfNHX1基因能增強擬南芥苗期的耐鹽性。同樣，在添加10 μM ABA脅迫激素的培養基上處理10 d，轉基因株系生長良好，葉片較大，而野生型的葉片黃化且生長受到嚴重抑制。轉化KfNHX1基因的擬南芥能夠降低擬南芥苗期對ABA敏感性。圖5

注：A、B：分別為正常生長和120 mM NaCl脅迫下的根長表型；C：根長分析；D：10 μM 和15 μM ABA脅迫下的生長表型

研究表明，成苗的擬南芥，在正常條件下，野生型和轉基因擬南芥的生長良好且無差異，200 mM NaCl脅迫15 d時，野生型植株大多生長抑制、枯萎甚至死亡，轉基因擬南芥普遍長勢較好。利用原子吸收分光光度計測定鹽脅迫下野生型和轉基因擬南芥葉中的Na+和K+含量的結果顯示轉基因植株中Na+和K+含量都高于野生型。KfNHX1基因可能增強了將Na+區隔化至液泡的能力，提高了轉基因擬南芥的耐鹽性。圖6

注：200 mM NaCl處理下的擬南芥的生長表型(A)、擬南芥葉中的Na+含量(B)和K+含量(C)

3 討 論

高鹽造成植物水分虧缺、離子毒害，是世界農作物減產的主要原因[11]。其中液泡膜Na+/H+反向運輸載體能將胞質中的Na+區隔化至液泡中，維持胞質內較低的Na+水平，來減輕Na+對植物造成傷害[12]。

在擬南芥、番茄、油菜和棉花中過量表達AtNHX1，在200 mM Nacl處理下均能提高轉基因的耐鹽性。其中轉基因棉花產量增加和產生更多棉纖維的現象[13-16]。將互花米草SaNHX2基因過表達至擬南芥，在200 mM NaCl脅迫條件下，與野生型相比，轉基因擬南芥的葉綠素含量更高、根更長，和脅迫應答基因的表達量增加明顯[17]。過量表達棗樹PdNHX6基因至擬南芥，轉基因株系的Na+和K+含量均高于野生型，PdNHX6可能增強了擬南芥將Na+區隔化至液泡的能力，從而提高了轉基因擬南芥的耐鹽性[18]。

鹽爪爪是生長于鹽堿荒漠區多年生積鹽鹽生植物，葉肉質、多汁[9]。利用農桿菌介導法將KfNHX1基因轉化至擬南芥進行耐鹽功能分析。鹽脅迫下，轉基因擬南芥種子的萌發率、根長和成苗的生長表型明顯優于野生型，Na+和K+含量也高于野生型，表明鹽爪爪KfNHX1能夠增強擬南芥的耐鹽性。這與文獻中報道在擬南芥中GhNHX1[19]、ZmNHX1[20]、SsNHX1[6]和MsNHX1[21]的過表達通過提高積累Na+來增強其耐受性的結果一致。

ABA是一種重要的植物脅迫激素，參與種子休眠、萌發和幼苗生長等發育過程及植物的非生物脅迫的信號轉導過程[22-24]。過表達水稻OsPP108的擬南芥植株在種子萌發、根生長和幼苗生長過程中對ABA高度不敏感，對高鹽和甘露醇脅迫耐受性強[25]。在外源ABA處理下，轉大麥HbMBF1a擬南芥都具有較高的子葉綠化率、幼苗根長和逆境響應基因的表達量，增強了轉基因擬南芥的ABA不敏感性，是ABA反應的正調控因子[26]。也開展了轉KfNHX1基因擬南芥對ABA的脅迫耐受性，通過萌發率和幼苗的生長表型來看，轉基因擬南芥降低了對ABA的敏感性，與一些文獻的研究結果一致[27-28]。

4 結 論

以農桿菌介導花序浸染法將KfNHX1基因轉入擬南芥中并獲得了T3代純合株系。鹽脅迫下轉基因株系的擬南芥種子的萌發率和根長明顯高于野生型。結合200 mM NaCl脅迫處理15 d下的擬南芥成苗表型，相較野生型葉片萎黃和死亡，轉基因植株的生長狀況較好，且積累了較高的Na+和K+。異源表達KfNHX1能夠提高轉基因擬南芥的耐鹽性。