綿羊Myostatin前肽對成肌細胞的分化作用

杜 瑋，夏 俊，劉明軍，張 楊

(新疆畜牧科學(xué)院畜牧研究所，烏魯木齊 830000)

0 引 言

【研究意義】一種從小鼠骨骼肌cDNA文庫中克隆的新的轉(zhuǎn)化生長因子—Myostatin，具有抑制骨骼肌生長的功能[1、2]。1997年Grobet，Kambadur發(fā)現(xiàn)皮爾蒙特牛和比利時蘭牛這2個牛具有雙肌性狀，大腿、臀部、胸部、上臂等肌肉異常發(fā)達，肌肉質(zhì)量較普通牛高出了20%～25%，經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)引起這種表型的原因是Myostatin基因的自然突變現(xiàn)象；2006年Alex Clop研究發(fā)現(xiàn)Texel雙肌綿羊和普通綿羊相比，具有明顯雙肌現(xiàn)象，肌肉肥大、肌肉生長速度快、體型龐大、肉骨比高、瘦肉率高、產(chǎn)羔率高等特性，分析其原因Myostatin基因編碼區(qū)沒有差異， 3’端非翻譯區(qū)(3’UTR)發(fā)生作用位點G→A的突變，這個突變產(chǎn)生了microRNA1和microRNA206兩種microRNA，進而抑制了Myostatin基因的翻譯，Myostatin 基因的功能被破壞，這種突變導(dǎo)致特克塞爾羊(Texel sheep)出現(xiàn)了雙肌性狀；從一個兒童的Myostatin基因中檢測到一個鳥嘌呤突變成腺嘌呤。這個突變處于外顯子1的下游，導(dǎo)致了第108位堿基對的錯誤剪接，Myostatin基因突變同樣可以引起人類嬰兒的肌肉發(fā)達[3-5]。Myostatin作為一種重要的負(fù)調(diào)控因子，發(fā)現(xiàn)在生物育種及醫(yī)學(xué)等學(xué)科的發(fā)展起著舉足輕重的作用，已經(jīng)成為分子生物學(xué)界的重要研究課題。【前人研究進展】研究表明增加Myostain前肽的量，可以抑制或影響Myostatin的生物學(xué)活性。Yang(2001)研究發(fā)現(xiàn)將Myostain前肽蛋白過表達的轉(zhuǎn)基因小鼠體重增加了20%～110%，其他性狀不受干擾，小鼠可以正常繁殖。將突變前肽注射到小鼠體內(nèi)，小鼠肌肉量增加了25%～30%[6]。Neil等(2003)研究發(fā)現(xiàn),鼠Myostain 前肽的第76位天冬氨酸(Asp)是金屬蛋白酶家族BMP-1/TLD 的特異性切割位點，金屬蛋白酶切割Myostain 前體后，能釋放出C端二聚體，C 端二聚體與相應(yīng)的受體結(jié)合進而激活下游信號通路；將天冬氨酸突變?yōu)楸彼?Ala)以后，突變的前肽依然能夠與C 端二聚體以潛在復(fù)合物的形式結(jié)合，但卻不能被BMP-1/TLD 蛋白酶水解[7]。【本研究切入點】慢病毒載體(Lentiviral vector, LVs)是在 HIV-1病毒(人類免疫缺陷I型病毒)基礎(chǔ)上改造而成的病毒載體系統(tǒng)，安全性很高，能夠?qū)⑼庠椿虿迦爰毎蚪M內(nèi)，實現(xiàn)目的基因的穩(wěn)定表達，對分裂細胞和非分裂細胞均具有感染能力。【擬解決的關(guān)鍵問題】通過基因工程手段將Myostatin前肽進行基因修飾，把Myostatin前肽的第76位天冬氨酸突變?yōu)楸彼?D76A)，構(gòu)建基因優(yōu)化后的Myostatin前肽過表達慢病毒質(zhì)粒，包裝慢病毒，并檢測Myostatin前肽對C2C12細胞的分化能力，研究Myostatin前肽蛋白的表達對動物肌肉生長發(fā)育的影響及其調(diào)控機制提供試驗依據(jù)，為以抑制Myostatin基因功能為目的的生物制劑的研究奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

胎牛血清Thermo；DMEM Thermo；Age I和NotI購自New England Biolabs公司；LATaqDNA聚合酶購自TaKaRa生物公司；IPTG、X-gal和DNA marker購自北京全式金公司；大腸桿菌菌株DH5α、PBS、PCR產(chǎn)物回收純化、質(zhì)粒小提、大量抽提試劑盒、細胞RNA提取試劑盒均購自上海生工；細胞轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000 、一抗(Anti-β-actin rabbit polyclonal antibody，Anti-Flag rabbit polyclonal antibody)，二抗(HRP-conjugated Goat Anti-rabbit IgG)、 載體及三質(zhì)粒系統(tǒng)：pHBLV-CMV-MCS-3flag-EF1-ZSgreen-puro，pSPAX2、pMD2G、MSTN-part質(zhì)粒均購自Invitrogen公司。小鼠成纖維細胞株C2C12、293T由該實驗室提供。

1.2 方 法

1.2.1 Myostatin前肽過表達慢病毒重組質(zhì)粒的構(gòu)建及制備

根據(jù)GenBank中綿羊MSTN全長mRNA序列(NM_001009428)，使用Oligo 6.0軟件設(shè)計引物，擴增大小為750 bp的Myostatin前肽基因Lv-MSTN-F:ctagaggatctatttccggtgaattcgccaccATGAATGAGAACAGCGAGC

LV-MSTN-R:cttctagaactagtctcgaggaattCTCTCCTAGATCTTTTTGGTGTGTCTG

PCR擴增采用如下體系：KOD plus DNA polymerase 1 μL，10×Buffer 5 μL，MgSO4(25 mmol/L) 2 μL，dNTPs(2 mmol/L) 5 μL，引物各1 μL (10 μmol/L)，補水至50 μL。PCR反應(yīng)程序： 95℃ 5 min；94℃ 20 s，55℃ 20 s，72℃ 60 s，35個循環(huán)；72℃延伸10 min。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，DNA測序比對證實序列正確后，將其插入pHBLV-CMV-MCS-3flag-EF1-ZSgreen-puro載體中，后用T4DNA連接酶連接。將連接反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化TOP10感受態(tài)細菌，調(diào)取單克隆菌落，PCR擴增篩選，對鑒定的陽性質(zhì)粒送上海生工公司進行測序。驗證正確的重組質(zhì)粒命名為LV-CMV-MSTN-flag-GFP。

1.2.2 Myostatin前肽過表達慢病毒的包裝

病毒包裝前進行293T細胞培養(yǎng)，第1 d取對數(shù)生長期293T細胞，接種于直徑為15 cm的細胞培養(yǎng)皿，第2 d待細胞密度達70%～80%時用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染，進行病毒包裝。分別用250 μL Opti-MEM培養(yǎng)基稀釋4 μg質(zhì)粒和8 μL脂質(zhì)體Lipofectamine 2000，兩者混合后室溫靜置20 min，加入培養(yǎng)皿中，6 h后換液，37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，采用熒光顯微鏡觀察綠色熒光表達后收集上清液。按照要求分裝病毒，標(biāo)記，-80℃冰箱保存[8]。

1.2.3 滴度檢測

第1 d將293T細胞消化后稀釋至1×105/mL, 加入96孔板，100 μL/孔，為每個病毒準(zhǔn)備6個孔。放入37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 第2 d，準(zhǔn)備6個1.5 mL離心管，第1個離心管中加入病毒液10 μL，做3倍梯度稀釋，共6個稀釋度。第3 d，有需要加puro篩選的孔，先吸去100 mL含病毒培養(yǎng)基，加入100 μL含1.5 μg/mL puro的10%FBS完全培養(yǎng)基。最后觀察結(jié)果并計算滴度，在觀察結(jié)果前6 h更換新鮮10%FBS完全培養(yǎng)基，從孔中吸出80 μL培養(yǎng)基，再加入80 μL新鮮10%FBS完全培養(yǎng)基，置37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。6 h后熒光顯微鏡下觀察結(jié)果，以熒光百分比為10%～30%的孔計算病毒滴度。

滴度(TU/mL )=細胞數(shù)×熒光百分比×MOI(1)×病毒稀釋倍數(shù)×103。

1.2.4 C2C12細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

取正常培養(yǎng)的C2C12細胞，長滿后分板，按照每個6孔板一個孔50萬細胞鋪板，12 h后進行感染。取2支1.5 mL的EP管，每管加入800 μL的完全培養(yǎng)基，并且分別加入200 μL的LV-CMV-MSTN-flag-GFP、LV-CMV-GFP病毒，MOI=20，再分別加入終濃度為5 μg/mL的polybrene，混勻后靜置5 min。另取第3支1.5 mL EP管，加入1 mL完全培養(yǎng)基。將準(zhǔn)備好的細胞去除培養(yǎng)液，將混勻后的病毒液體分別加入不同的孔。37℃，5%CO2，培養(yǎng)48 h后顯微鏡觀察，并加入嘌呤霉素進行穩(wěn)定株篩選。篩選后細胞收樣，提取蛋白進行WB檢測。

1.2.5 成肌細胞分化誘導(dǎo)及其指標(biāo)測定

按4×105/孔的細胞量接種至6孔板中培養(yǎng)，24 h后匯合度達到80%，換用含體積分?jǐn)?shù)2%馬血清的DMEM誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)72 h，進行固定及封閉，加入肌球蛋白重鏈單克隆抗體(anti-MyHC)(稀釋比為1∶400)，4℃過夜，TBS沖洗后加入山羊抗鼠熒光二抗(FITC-IgG)(1∶200)及100 ng/mL細胞核染色劑 DAPI，室溫作用1 h，TBS沖洗，Nikon熒光顯微鏡成像。

使用NIS-Elements(Nikon)軟件測量視野內(nèi)肌管中細胞核的數(shù)目，用MyHC陽性的細胞個數(shù)除以整個視野中細胞核數(shù)目，所得的百分?jǐn)?shù)即為肌管融合率；使用軟件測量視野中每條肌管直徑大小，統(tǒng)計直徑最大的20個數(shù)據(jù)，取其平均值作為該視野的肌管直徑值。每孔隨機選取10個視野的細胞，取其均值使用SPSS 13.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。

1.2.6 Western blot檢測蛋白表達

選用穩(wěn)定表達目的基因的細胞株接種于6孔板中，待長滿后即可進行實驗。吸出培養(yǎng)基，用0.01 mol PBS沖洗3遍后加入細胞裂解液，提取細胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，取適量蛋白進行十二烷基硫酸鈉一聚丙烯酰胺膠體電泳(SDS-PAGE)凝膠電泳，將蛋白用電轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)印到聚偏二氟乙烯膜(PVDF)上，用含5%脫脂奶粉封閉液(TBST)浸泡PVDF膜，室溫?fù)u床封閉1 h。用一抗稀釋液稀釋相應(yīng)的一抗(Anti-β-actin rabbit polyclonal antibody，Anti-Flag rabbit polyclonal antibody)，使PVDF膜浸泡于一抗孵育液中，4℃孵育過夜。TBST充分洗滌PVDF膜3次，10 min/次。用TBST稀釋HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗(HRP-conjugated Goat Anti-rabbit IgG)1∶5 000稀釋，使PVDF膜浸泡于二抗孵育液中，室溫?fù)u床孵育1 h。TBST充分洗滌PVDF膜5次，10 min/次。將ECL試劑中增強液與穩(wěn)定的過氧化物酶溶液按1∶1比例混勻，滴加工作液于PVDF膜上，發(fā)光顯影。

2 結(jié)果與分析

2.1 Myostatin前肽克隆

研究表明，獲得750 bp左右的片段，與理論大小相符，理論上Myostatin前肽為244aa即732 bp，732 bp加上下游酶切位點及保護性堿基18 bp，因此，片段長度為750 bp。圖1

注：M:10 000 bp marke，1、2：Myostatin前肽

2.2 Myostatin前肽過表達慢病毒載體的構(gòu)建和鑒定

用T4 DNA連接酶將Myostatin前肽的PCR產(chǎn)物連接到慢病毒載體pHBLV-CMV-MCS-3flag-EF1-ZSgreen-puro，構(gòu)建重組質(zhì)粒，經(jīng)EcoR1酶切后可見有約10 000 bp的線性條帶；慢病毒載體大小為8 974 bp，目的基因即Myostatin前肽為750 bp，構(gòu)建了重組質(zhì)粒。圖2

注：M:10 000 bp marker；1、慢病毒載體膠回收結(jié)果；慢病圖載體圖譜

研究表明，PCR擴增所得產(chǎn)物約1 000 bp(羊Myostatin前肽序列片斷長度為750 bp+載體部分序列300 bp)，將陽性克隆送測序，與預(yù)期結(jié)果完全一致，構(gòu)建了Myostatin前肽的慢病毒重組質(zhì)粒，將其命名為LV-CMV-MSTN-flag-GFP。圖3

注：1-7：MSTN-part單克隆鑒定PCR產(chǎn)物；M：10 000 bp DNA Marker

2.3 Wb檢測

研究表明，LV-CMV-MSTN-flag-GFP感染C2C12細胞后， Myostatin前肽的表達水平顯著上調(diào)，在Western blot反應(yīng)的抗原固定后，用一抗和辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗反應(yīng)顯色后，肉眼觀察顯色反應(yīng)后的顏色深淺，即作為一種定性的判斷，LV-CMV-MSTN-flag-GFP在靶細胞中能夠有效上調(diào)目的基因Myostatin前肽的表達。圖4

注：C2C12-Blank：空白對照組；C2C12-NC：LV-CMV-GFP感染組；C2C12-MSTN：LV-CMV-MSTN-flag-GFP感染組

2.4 滴度

通常滴度單位為TU/mL，指每毫升中含有的具有生物活性的病毒顆粒數(shù)。IU/mL，指每毫升中含有的整合活性的病毒顆粒數(shù)。“IU”為integration units的縮寫，中文為整合單位，測定病毒滴度的方法是在熒光顯微鏡下觀察，計算病毒滴度(病毒滴度=發(fā)綠色熒光的細胞數(shù)×病毒稀釋倍數(shù))。

對照組滴度=4×104×10%×MOI(1)×病毒稀釋倍數(shù)(30)×103=1×108TU/mL(選取0.033 μL病毒孔)

試驗組滴度=4×104×10%×MOI(1)×病毒稀釋倍數(shù)(30)×103=1×108TU/mL(取0.033 μL病毒孔)圖5

圖5 滴度測定Fig.5 Viral titers identification

2.5 過表達Myostatin前肽對成肌細胞的分化

2.5.1 免疫熒光檢測結(jié)果

分別用過表達Myostatin前肽的慢病毒重組質(zhì)粒(LV-CMV-MSTN-flag-GFP)和空載體(LV-CMV-GFP)慢病毒感染C2C12細胞，72 h后觀察LV-CMV-MSTN-flag-GFP和LV-CMV -GFP感染效率。研究表明，實驗組明顯的長條狀肌管，Myostatin前肽基因的過表達顯著抑制了Myostatin基因的表達，從而影響肌管的形成，抑制了分化的進程。圖6

注：B：未處理的C2C12細胞；NC：感染LV-CMV-GFP的C2C12陰性對照細胞株；MSTN：感染LV-CMV-MSTN-flag-GFP的C2C12實驗組

2.5.2 肌管融合率的測定

試驗共計測定了3個重復(fù)。研究表明，作為分化指標(biāo)的肌管融合率，未處理組、對照組、試驗組肌管融合率分別為5.38%、5.62%、9.38%，試驗組即轉(zhuǎn)染Myostatin前肽的肌管融合率顯著高于對照組和未處理組(P<0.05)。表明Myostatin前肽過表達細胞在分化程度上顯著高于非轉(zhuǎn)化成肌細胞，Myostatin前肽基因的過表達顯著促進了成肌細胞的分化。分析原因是過量的Myostatin前肽轉(zhuǎn)染成肌細胞后，可以與Myostatin成熟肽結(jié)合，抑制了Myostatin的功能，促進了肌管的形成。圖7

注：B: 未處理的C2C12細胞；NC：感染LV-CMV-GFP的C2C12陰性對照細胞株；MSTN感染LV-CMV-MSTN-flag-GFP的C2C12實驗組;不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)

Note: B:parent cell control; NC: 感染LV-CMV-GFP的C2C12陰性對照細胞株；MSTN：感染Untreated C2C12 cells; NC: C2C12 negative control cell lines infected with LV-CMV-GFP; MSTN: C2C12 treatment group infected with LV-CMV-MSTN-flag-GFP, Different small letter is considered as significant (P<0.05)

圖7 成肌細胞系肌管融合率
Fig.7 Statistical analysis of fusion index.

3 討 論

Myostatin主要由骨骼肌產(chǎn)生，以劑量依賴性發(fā)揮作用，是一種分泌蛋白，并且以濃度依賴性的方式限制肌纖維生長。Myostatin分為前肽和成熟肽兩部分，Myostatin前肽位于Myostatin基因的N末端，Myostatin成熟肽位于Myostatin基因的C端是真正具有生物學(xué)活性的部分。Myostatin最初在血液中是以沒有生物活性的前體蛋白形式循環(huán)的，當(dāng)機體需要時，該前體蛋白運輸?shù)絻?nèi)質(zhì)網(wǎng)膜后首先被切除信號肽，然后在裂解位點(RSRR)被金屬蛋白酶切割，去掉前肽(N端)，剩余的成熟肽通過半胱氨酸之間的二硫鍵形成同源二聚體，該二聚體可以與N端前肽構(gòu)成潛在復(fù)合體。Wolfman et al.2003研究表明，潛在復(fù)合體中前肽部分的第76位氨基酸即天冬氨酸(Asp)是金屬蛋白酶家族 BMP-1/TLD 的特異性切割位點，當(dāng)該位點被此類酶水解后就可以釋放出具有生物學(xué)活性的C端二聚體[9]。當(dāng)將Myostatin前肽第76位天冬氨酸突變?yōu)楸彼岷螅饘俚鞍酌讣易?BMP-1/TLD就無法對其進行切割，無法釋放出C-端二聚，人為增加突變型Myostatin前肽的量，Myostatin前肽會與Myostatin成熟肽結(jié)合，從而起到抑制Myostatin生物活性的作用。

Lee et al.2001; Yang et al.2001研究表明，過表達Myostatin前肽可以顯著的降低體外培養(yǎng)的細胞以及轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)Myostatin基因的生物活性。過表達Myostatin前肽可顯著的增加轉(zhuǎn)基因小鼠的肌肉質(zhì)量[5、6]。

Neil等(2003)研究發(fā)現(xiàn)鼠Myostatin前肽的第76 位天冬氨酸(Asp)是金屬蛋白酶家族BMP-1/TLD 的特異性切割位點，當(dāng)該位點被金屬蛋白酶水解后，釋放出具有生物活性的C端二聚體，C 端二聚體與相應(yīng)的受體結(jié)合進而激活下游信號通路[7]；Wolfman et al.2003; ZiCong Li et al.2009研究表明，將天冬氨酸突變?yōu)楸彼?Ala)以后，突變的前肽依然能夠與C 端二聚體以潛在復(fù)合物的形式結(jié)合，但卻不能被金屬蛋白酶水解[9、10]；因此，將突變前肽注射到小鼠體內(nèi)，注射的前肽通過與Myostatin成熟肽結(jié)合，抑制Myostatin的生物學(xué)功能，進而增加小鼠肌肉量。S.R et al.2006研究表明，在小鼠5周時對其注射2倍劑量的突變型Myostatin前肽可以顯著的增加小鼠肌肉質(zhì)量，肌肉發(fā)達表型的增長主要是來自肌肉肥大而不是增生，同時證明突變型的Myostatin前肽是增加肌肉質(zhì)量的一種有效的方法[11]。

慢病毒載體(Lentiviral vector, LVs)是在 HIV-1病毒(人類免疫缺陷I型病毒)基礎(chǔ)上改造而成的病毒載體系統(tǒng)，區(qū)別一般的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，它的優(yōu)點在于能夠感染多種難感染的細胞，對分裂細胞和非分裂細胞均具有感染能力，且慢病毒能夠?qū)⑼庠椿虿迦爰毎蚪M內(nèi)，實現(xiàn)目的基因的穩(wěn)定表達。于此同時，慢病毒安全性很高，不產(chǎn)生任何有效的細胞免疫應(yīng)答。

試驗通過對Myostatin前肽進行基因修飾，把Myostatin前肽的第76位天冬氨酸突變?yōu)楸彼?D76A)，Myostatin前肽的第76位天冬氨酸(Asp)是蛋白酶家族BMP-1/TLD特異性切割位點，Myostatin前體被該蛋白酶處理后，能釋放本來與前肽非共價結(jié)合的C端二聚體活性分子，使其能夠與相應(yīng)受體結(jié)合，激活下游信號傳導(dǎo)通路。當(dāng)Myostatin的前肽第76位天冬氨酸突變?yōu)楸彼?D76A)后，能更有效地抑制C端二聚體的活性。于此同時，考慮到將Myostatin前肽突變載體轉(zhuǎn)染到小鼠成肌細胞(C2C12)轉(zhuǎn)染效率不高的問題，使用了慢病毒載體，成功構(gòu)建了Myostatin前肽過表達慢病毒載體，在C2C12細胞上轉(zhuǎn)染，并進行免疫熒光及Western blot檢測。結(jié)果表明，在熒光視野下，感染過表達Myostatin前肽的慢病毒重組質(zhì)粒(LV-CMV-MSTN-flag-GFP)的試驗組中可見明顯的肌管，表明Myostatin前肽基因的過表達顯著抑制了Myostatin基因的表達，從而促進了肌管的形成。Western blot檢測結(jié)果顯示，LV-CMV-MSTN-flag-GFP在靶細胞中能夠有效上調(diào)目的基因Myostatin前肽的表達。通過試驗結(jié)果說明，構(gòu)建的Myostatin前肽過表達慢病毒載體對成肌細胞分化作用是有效的，通過Western blot和C2C12細胞分化試驗初步鑒定其體外生物學(xué)活性，為體內(nèi)生物學(xué)功能試驗和制備綿羊Myostatin前肽生物制劑打下基礎(chǔ)。

4 結(jié) 論

構(gòu)建過表達Myostatin前肽的慢病毒重組質(zhì)粒(LV-CMV-MSTN-flag-GFP)，將LV-CMV-MSTN-flag-GFP包裝成慢病毒。感染C2C12細胞后，進一步證實了過表達Myostatin前肽存在抑制Myostatin生物學(xué)功能的特性，促進了成肌細胞的分化。