Notch1/Hes1信號通路在調控低分化胃腺癌細胞鈣離子和侵襲能力中的作用

張競文，黃菱燕，秦 憬，呂懷盛，景 麗

胃癌是人類常見的惡性腫瘤，其預后與腫瘤分化程度、轉移等密切相關。低分化胃腺癌與高分化胃腺癌相比，侵襲性更強、預后更差[1-4]。近年研究提示，細胞內鈣離子水平影響細胞周期、能量攝取，并且參與調節癌細胞的增殖、浸潤、轉移等[3,5]。鈣依賴性鈣蛋白酶家族(Calpain)是調控細胞鈣離子的重要成分，該家族包括Calpain-1與Calpain-2[3,6]。研究顯示，Calpain-1高表達可促進口腔鱗狀細胞癌浸潤和轉移[6]。Hes1基因是Notch1信號通路的靶基因，在維持細胞的未分化狀態、分化方向中發揮重要作用[1,4,7]。已有研究顯示，Notch1信號通路參與胃癌細胞增殖能力的調節[1]；Hes1在胃癌浸潤和轉移過程中發揮作用，胃癌組織浸潤深度、淋巴結轉移及腫瘤分期均與Hes1高表達相關[1-2]；在進展期胃癌以及侵襲能力強的胃癌細胞系也有比較高的Hes1表達[7]。目前，Hes1基因參與胃癌進展的分子機制尚不清楚，Notch1/Hes1對胃癌細胞鈣離子的影響有待于進一步分析。本文采用免疫組化、基因沉默、Transwell、Flou-4、Western blot法檢測低分化胃腺癌、MGC-803胃癌細胞中Notch1/Hes1蛋白表達及其對鈣離子水平的影響，探討Notch1/Hes1對胃癌細胞鈣離子水平及侵襲力的影響。

1 材料與方法

1.1 材料收集2016～2018年寧夏醫科大學總醫院收治的低分化胃腺癌及癌旁正常組織各32例。MGC-803人低分化胃癌細胞株購自北京北納生物公司。實驗所用試劑購自北京中杉金橋公司和武漢博士德公司，主要包括Notch1、Hes1、Calpain-1(Abcam 公司)，vimentin、E-cadherin、β-actin兔多克隆抗體(Proteintech 公司)，RPMI 1640培養基、青鏈霉素、胰蛋白酶-EDTA消化液、胎牛血清(HyClone公司)，Flou-4 AM鈣離子檢測試劑盒(Thermo Fisher Scientific公司)，總蛋白提取試劑盒(索萊寶公司)，Transwell小室(Corning公司)，Lipofectamine 2000 Transfection Reagent(Invitrogen公司)，ECL超敏發光液(Thermo Fisher Scientific公司)，Matrigel基質膠(BD公司)。

1.2 方法

1.2.1分組 32例低分化胃腺癌為胃癌組，32例癌旁正常組織為對照組。標本均經10%中性福爾馬林固定，常規取材，石蠟包埋、切片。MGC-803人低分化胃癌細胞株分為對照組、Lipofectamine 2000組、Notch1 siRNA組、Hes1 siRNA組。

1.2.2免疫組化 采用免疫組化SP法進行染色，主要步驟如下：(1)切片經脫蠟，水化；(2)檸檬酸緩沖液微波抗原修復；(3)一抗4 ℃孵育過夜，Notch1(1 ∶200)、Hes1(1 ∶500)、Calpain-1(1 ∶500)、E-cadherin(1 ∶200)；(4)二抗37 ℃孵育1 h，DAB顯色；(5)蘇木精復染，脫水，透明，封固。以PBS代替一抗作為陰性對照，光鏡觀察，≥10%的癌細胞陽性著色為陽性。

1.2.3Notch1 siRNA和Hes1 siRNA轉染 本組參考Lipofectamine 2000轉染試劑說明書操作，主要步驟如下：(1)無血清培養24 h，Lipofectamine 2000與對應siRNA預混配置成工作液，工作濃度為100 nmol/L，室溫孵育25 min；(2)取對數增殖期的MGC-803細胞，按每孔8×105個細胞平鋪在6孔板中，穩定培養24 h；(3)待生長融合度約50%時，更換siRNA預混工作液，繼續孵育24 h；(4)更換含血清培養基工作液，繼續培養24 h；(5)收集和檢測各組中Notch1、Hes1的蛋白表達。Notch1 siRNA正向引物5′-GAAUUUGGGAGCUGUUUAUTG-3′，反向引物5′-AUAAACAGCUCCCAAAUUCTG-3′；Hes1 siRNA正向引物5′-GAAUUUGGGAGCUGUUUAUTG-3′，反向引物5′-AUAAACAGCUCCCAAAUUCTG-3′。

1.2.4Flou-4 AM檢測 取對數增長期細胞，接種于6孔板中(5×105個/孔)，37 ℃、48 h。加入1 mL培養基工作液和1 mL Flou-4 AM染色工作液，37 ℃、20 min。吸除上清，Flou-4 AM染色緩沖液(1×)洗滌2次，加入2 mL細胞培養液。熒光顯微鏡下觀察拍照，IPP 6.0軟件進行結果分析。

1.2.5Transwell實驗 Matrigel預包被Transwell小室；將細胞接種于Matrigel預包被Transwell小室的上室(5×105個/室)，加無血清培養液，下室加含血清液培養，37 ℃、48 h。標本經4%多聚甲醛固定10 min，棉簽拭去上層未轉移的細胞，下層結晶紫染色并細胞計數。

1.2.6Western blot檢測 取對數生長期的MGC-803低分化胃癌細胞，各組細胞經預處理后，應用全蛋白提取試劑盒提取蛋白。提取前30 min配裂解液，4 ℃放置5 min，劇烈震蕩30 s，合計5個循環，離心去除細胞碎片及雜質，分裝蛋白。應用蛋白含量檢測試劑盒測OD值，100 ℃、10 min，上樣。1×SDS蛋白上樣緩沖液進行SDS-PAGE電泳，轉移至NC膜，用5%脫脂奶粉37 ℃封閉1 h。一抗Notch1(1 ∶1 000)、Hes1(1 ∶1 000)、Calpain-1(1 ∶500)、vimentin(1 ∶1 000)、E-cadherin(1 ∶1 000)、和β-actin(1 ∶3 000)4 ℃孵育過夜。二抗(1 ∶3 000)37 ℃孵育1 h。采用ECL化學發光顯影劑顯影并曝光保存。應用Image J軟件測量條帶灰度值，以β-actin作為內參，以兩者灰度值的比值表示相對蛋白表達量。

2 結果

2.1 臨床特點32例低分化胃腺癌中男性23例，女性9例，年齡36～77歲，中位年齡56歲。其中黏膜下層以內的早期胃癌3例(9.38%)，中晚期胃癌29例(90.62%)。32例均符合低分化腺癌的組織學特征，癌細胞形成條索狀(圖1A)、團塊狀、小片狀癌巢，可見不規則腺管樣結構，浸潤性生長。癌旁黏膜組織主要為幽門腺(圖1B)和胃體腺，可見腸上皮化生及不典型增生。免疫組化結果顯示，本組32例均表達腺癌的陽性指標CK20(圖1C)，Ki-67增殖指數為26.64%±6.83%(圖1D)，證實為低分化胃腺癌。

2.2 免疫表型本組癌旁正常腺體可見少數細胞出現Notch1、Hes1表達，低分化胃腺癌組織中Notch1、Hes1表達明顯增多，主要表達于細胞質，少數細胞為細胞核表達。在癌旁正常腺體可見少數細胞有Calpain-1蛋白表達，主要表達于細胞膜，低分化胃腺癌組織中Calpain-1蛋白強表達，定位于細胞質和細胞核。癌旁組織中E-cadherin彌漫表達，低分化胃腺癌組織中E-cadherin偶見陽性細胞。經χ2檢驗，Notch1、Hes1、Calpain-1、E-cadherin蛋白在低分化胃腺癌組織(陽性率分別為93.75%、96.88%、96.88%和25.0%)與癌旁組織(陽性率分別為21.88%、18.75%、25.0%和93.75%)的表達差異有顯著性(P<0.05)，低分化胃腺癌組織中Hes1、Notch1、Calpain-1表達明顯高于癌旁正常組織(P<0.05)，E-cadherin表達明顯低于癌旁正常組織(P<0.05，圖2)。

2.3 Notch1和Hes1 siRNA檢測將Notch1 siRNA和Hes1 siRNA干擾序列轉染MGC-803細胞，培養48 h后，Western blot檢測細胞中Notch1和Hes1的蛋白表達(圖3A)，結果顯示Notch1和Hes1的蛋白表達明顯降低(圖3B)，提示干擾成功。

圖1 A.胃低分化腺癌，癌細胞排列呈條索狀； B.癌旁正常黏膜組織，為幽門腺；C.胃低分化腺癌中CK20呈陽性，SP法；D.胃低分化腺癌中Ki-67呈陽性，SP法

2.4 Transwell檢測培養48 h 后，在對照組和Lipofectamine 2000組均可見多量癌細胞遷移(圖4A、B)，而Notch1 siRNA組和Hes1 siRNA組癌細胞遷移明顯減少(圖4C、D)；對照組、Lipofectamine 2000組[每視野分別為(340±46)個細胞和(348±63)個細胞]與Notch1 siRNA組和Hes1 siRNA組遷移細胞數量[每視野分別為(95±22)個細胞和(63±26)個細胞]差異有統計學意義(P<0.05)，Notch1 siRNA和Hes1 siRNA轉染均可顯著減少MGC-803胃癌細胞的遷移。

2.5 胃癌細胞鈣離子水平檢測本組經Flou-4檢測不同分組MGC-803細胞鈣離子水平結果顯示，在對照組和Lipofectamine 2000組，癌細胞鈣離子分別為0.39和0.38(圖5A、B)；與對照組和Lipofectamine 2000組比較，Notch1 siRNA組(0.11)和Hes1 siRNA組(0.14)胃癌細胞鈣離子水平明顯降低(P<0.05，圖5C、D)；而Notch1 siRNA與Hes1 siRNA兩組間癌細胞的鈣離子水平，差異無統計學意義(P>0.05)。

2.6 Western blot檢測本組Western blot結果顯示，在對照組、Lipofectamine 2000組、Notch1 siRNA組和Hes1 siRNA組均可見Calpain-1、vimentin、E-cadherin蛋白表達(圖6A)；與對照組和Lipofectamine 2000組比較，Notch1 siRNA組和Hes1 siRNA組Calpain-1、vimentin的表達均降低，而E-cadherin表達明顯增加；經蛋白相對表達量分析，Notch1 siRNA和Hes1 siRNA轉染可降低vimentin和Calpain-1、E-cadherin的表達(P<0.05)，增加E-cadherin的表達(P>0.05，圖6B)。Notch1 siRNA與Hes1 siRNA兩組間差異無統計學意義(P>0.05)。

3 討論

胃癌是病死率較高的惡性腫瘤之一，其侵襲能力和轉移是影響患者生存的主要因素[1,5]。已有研究提示，有多種因素能夠影響癌細胞的增殖以及浸潤[4,8]。本組32例低分化胃腺癌組織中Notch1、Hes1、Calpain-1表達明顯增多，E-cadherin表達明顯低于癌旁組織；與以往報道基本一致[2,4]，Notch1和Hes1蛋白高表達參與低分化腺癌的侵襲能力調控[2,4-5]。本組低分化胃腺癌組織Calpain-1表達明顯高于癌旁組織，與口腔鱗狀細胞癌研究結果基本一致[6]，提示低分化胃腺癌涉及鈣離子水平的異常變化[3,6]。

圖2 癌旁組織和胃癌組織中蛋白免疫組化染色：癌旁組織中少數細胞Notch1、Hes1和Calpain-1蛋白呈陽性，E-cadherin呈彌漫陽性，SP法；胃癌組織中癌細胞Notch1、Hes1和Calpain-1蛋白均呈彌漫陽性，癌細胞偶見E-cadherin呈陽性，SP法

圖3 Notch1 siRNA和Hes1 siRNA干擾效果：A.Western blot檢測Hes1、Notch1蛋白表達；B.相對灰度值統計分析；與對照組、Lipofectamine 2000組比較，*P<0.05

圖4 Transwell檢測細胞遷移：A.對照組，癌細胞密集； B.Lipofectamine 2000組，癌細胞豐富；C.Notch1 siRNA組，癌細胞減少；D.Hes1 siRNA組，癌細胞減少

圖5 Flou-4檢測細胞鈣離子水平：A.對照組，鈣離子信號增強； B.Lipofectamine 2000組，鈣離子信號彌漫增強；C.Notch1 siRNA組，鈣離子信號減少；D.Hes1 siRNA組，鈣離子信號減少

圖6 Western blot檢測：A.Western blot檢測vimentin、E-cadherin、Calpain-1蛋白表達；B.相對灰度值統計分析；與對照組和Lipofectamine 2000組比較，*P<0.05

已有研究證明，在胃癌發生、發展過程中，可有多種基因發揮調節作用[1,3,8]。Hes1屬于DNA結合蛋白，受Notch1信號調節，Notch1/Hes1信號調節通路在組織分化過程中發揮重要作用[1,7,9]。本組結果顯示，在MGC-803胃癌細胞進行Notch1 siRNA和Hes1 siRNA轉染后，Notch1和Hes1蛋白表達明顯降低，并可顯著減少癌細胞的遷移，再次提示Notch1/Hes1信號調節蛋白在胃癌細胞侵襲過程中發揮重要作用[1,2,4]。有研究提示，抑制Notch1/Hes1信號通路可顯著降低裸鼠結腸癌移植瘤的生長[10]。在人胃腺癌組織和小鼠胃種植瘤模型中可見，Notch1/Hes1和mTORC1信號通路顯著增強，促進胃癌細胞增殖[1]。體外研究提示，通過抑制Notch1/Hes1信號通路可減少癌細胞集落形成，降低胃癌細胞的侵襲能力[11]。

Calpain包括Calpain-1與Calpain-2，是調控細胞鈣離子的重要成分[6]。有文獻報道在癌細胞增殖、轉移過程中，均涉及鈣離子和鈣離子相關蛋白的作用[12-13]。本組結果顯示，低分化胃腺癌組織和MGC-803胃癌細胞中Calpain-1表達明顯增多，Notch1和Hes1基因沉默后，MGC-803胃癌細胞鈣離子水平以及其遷移能降低，并伴Calpain-1表達降低；提示高表達Calpain-1可能與癌細胞鈣離子水平升高及其遷移能力增加有關[12-13]。關于Notch1/Hes1信號通路在Calpain-1調控細胞鈣離子過程中的作用尚不清楚。Squecco等[12]報道細胞鈣離子水平與Notch1表達相互作用，參與調節乳腺癌MCF-7細胞的增殖和侵襲。Calpain-1高表達可增加癌細胞侵襲能力和耐藥性，抑制Calpain-1表達可促進癌細胞凋亡，逆轉順鉑耐藥性[14]。Ren等[6]報道口腔鱗狀細胞癌中高表達的Calpain-1能夠促進癌細胞浸潤和轉移。本組前期研究顯示胃癌發生過程中可出現Hes1高表達，并與C-myc和p53基因變化及CEA表達相關[4]。本組結果顯示，胃癌細胞侵襲能力與Notch1/Hes1蛋白高表達有關，同時伴Calpain-1高表達及細胞鈣離子水平升高；反之亦然，提示Notch1/Hes1信號通路參與Calpain-1相關的MGC-803細胞鈣離子水平調節[8,12,14]。

本實驗結果可見，低分化胃腺癌組織E-cadherin表達明顯降低，MGC-803細胞Notch1和Hes1基因沉默也可顯著降低vimentin和提高E-cadherin的表達；提示Notch1/Hes1信號通路還可通過細胞黏附、上皮-間質轉化參與胃癌細胞侵襲能力的調控[2,15]。Notch1/Hes1信號通路可能與細胞內鈣離子調控機制存在串擾關系，其最終作用可能涉及復雜的細胞信號網絡[1,3,15]。本實驗僅在單一類型的胃癌及其細胞株進行相關觀察，關于Notch1/Hes1蛋白參與細胞鈣離子水平調節的作用及其機制，尚需更深入的研究。