耐三代頭孢菌素沙門菌的耐藥基因分析*

黃曉黎，陳曉，王若南，陳瑜

(1.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院檢驗科，杭州 310003；2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗科，杭州 310006;3.浙江省臨床體外診斷技術(shù)研究重點實驗室，杭州 310003)

沙門菌是人類食源性疾病有關(guān)的主要病原體之一，可分為傷寒沙門菌和非傷寒沙門菌。輕度的沙門菌感染通常不需要抗菌藥物治療，但在幼兒、老年人和免疫功能低下者，沙門菌感染會引起傷寒、副傷寒、敗血癥等疾病，通常使用三代頭孢菌素或氟喹諾酮類抗菌藥物治療[1-2]。2017年世界衛(wèi)生組織(World Health Organization,WHO)發(fā)布的關(guān)于全球十二大耐藥性細菌排名，耐藥性沙門菌位列第八，屬于高度耐藥。攜帶β-內(nèi)酰胺酶類耐藥基因而導(dǎo)致對三代頭孢菌素耐藥的沙門菌，更是給臨床治療和疾病防控帶來巨大挑戰(zhàn)。頭孢噻肟(CTX)作為第一個用于臨床的三代頭孢注射劑，和頭孢他啶(CAZ)一樣，治療時均不易引起雙硫侖反應(yīng)[3]，應(yīng)用范圍廣，其耐藥性的變化更值得關(guān)注。本研究用CTX和CAZ篩選本地區(qū)臨床分離的沙門菌，篩查超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(extended-spectrum β-lactamase, ESBLs)和7種β-內(nèi)酰胺類耐藥基因，了解本地區(qū)耐三代頭孢菌素沙門菌的耐藥基因分布，為疾病的防控和治療提供真實可靠的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1菌株收集及篩選 收集浙江省5家醫(yī)院(浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院、杭州市兒童醫(yī)院、三門縣人民醫(yī)院、嘉興市第一醫(yī)院、嘉興市第二醫(yī)院)2016年1月至2018年12月分離的沙門菌，采用Vitek 2 Compact微生物鑒定儀進行細菌鑒定，MALDI-TOF Bruker Bio Typer進行鑒定確認。收集的沙門菌采用紙片擴散法(K-B法)進行常規(guī)藥物敏感試驗，包括：氨芐西林(AMP)、哌拉西林-他唑巴坦(TZP)、頭孢西丁(FOX)、頭孢唑啉(KZ)、頭孢呋辛(CXM)、CAZ、CTX、環(huán)丙沙星(CIP)、復(fù)方磺胺甲噁唑(SXT)、美羅培南(MEM)。藥敏結(jié)果判讀以美國臨床實驗室標準化協(xié)會(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)為參考標準[4]。選取對CTX和(或)CAZ耐藥的157株沙門菌，其中CTX耐藥、CAZ敏感或中介23株，CAZ耐藥、CTX敏感或中介54株，CTX和CAZ均耐藥80株。

1.2主要儀器及試劑 Vitek 2 Compact微生物鑒定儀及配套鑒定卡(法國生物梅里埃公司)，MALDI-TOF Bruker Bio Typer系統(tǒng)(德國Bruker公司)，DNA Engine PCR擴增儀、Mini-Protean 3水平電泳儀、Gel Doc XR+凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)；AMP、TZP、FOX、KZ、CXM、CAZ、CTX、CIP、SXT、MEM、頭孢噻肟/棒酸(CTC)、頭孢他啶/棒酸(CAC)藥敏紙片(英國Oxoid公司)，沙門菌診斷血清(60種)(寧波天潤生物藥業(yè)公司)，Taq DNA 聚合酶、100 bp DNA marker (TaKaRa公司)。

1.3血清學(xué)分型 通過使用Kauffman-White(K-W)血清學(xué)分型方法，采用玻片凝集試驗，對沙門菌進行血清學(xué)分型。

1.4ESBLs確證試驗 用無菌棉拭子蘸取0.5麥氏濁度單位的菌懸液，均勻涂布于M-H瓊脂平板。用藥敏紙片分配器將CTX、CAZ、CTC、CAC紙片貼于M-H瓊脂平板上，放置37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16～18 h。參照CLSI 2019大腸埃希菌ESBLs的確認標準，2組藥物中任何一組加棒酸后紙片的抑菌圈直徑比對應(yīng)的無棒酸藥物紙片的直徑≥5 mm，即判定為產(chǎn)ESBLs菌株[4]。

1.5耐藥基因檢測 用熱裂解法提取核酸，用PCR技術(shù)檢測沙門菌的7種β-內(nèi)酰胺類耐藥基因。參照文獻[5-8]合成引物，見表1，引物合成由上海生工生物公司完成。PCR反應(yīng)體系25 μL，包括2×Taq Master Mix 12.5 μL，10 μmol/L上、下游引物各0.5 μL，模板DNA 1.0 μL，ddH2O 10.5 μL。PCR反應(yīng)參數(shù)：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，退火30 s(退火溫度見表1)，72 ℃ 60 s，35個循環(huán)；72 ℃ 5 min。取5 μL擴增產(chǎn)物，經(jīng)15 g/L瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)拍照后分析結(jié)果。隨機選取1～3株各耐藥基因PCR陽性產(chǎn)物送上海生工生物公司進行正反序列測定，測序結(jié)果經(jīng)美國國家生物技術(shù)信息中心/局部序列比對基本檢索工具(NCBI/BLAST)比對確認。

1.6統(tǒng)計學(xué)分析 用SPSS 21.0軟件進行。計數(shù)資料以百分率(%)表示，兩組之間比較采用χ2檢驗、連續(xù)性校正χ2檢驗或Fisher檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

表1 沙門菌耐藥基因PCR檢測相關(guān)引物

2 結(jié)果

2.1沙門菌對常規(guī)藥物的耐藥情況 157株對CAZ和(或)CTX耐藥的沙門菌對AMP的耐藥率最高，達89.17%，其次為CAZ和CTX，分別為85.35%和65.61%，對TZP耐藥率較低，未發(fā)現(xiàn)對MEM耐藥菌株，見表2。

表2 沙門菌對常規(guī)藥物的耐藥率

2.2血清型分布 157株沙門菌分為20種不同的血清型，分別是鼠傷寒沙門菌94株、腸炎沙門菌26株、嬰兒沙門菌6株、紐波特沙門菌5株、倫敦沙門菌3株、斯坦利沙門菌3株、湯卜遜沙門菌3株、腸沙門菌副傷寒B血清型3株、德比沙門菌2株、阿貢那沙門菌2株、腸沙門菌副傷寒C血清型1株、病牛沙門菌1株、都柏林沙門菌1株、黃金海岸沙門菌1株、康科特沙門菌1株、里森沙門菌1株、蒙得維的亞沙門菌1株、明斯特沙門菌1株、腸沙門菌傷寒血清型1株、塔克松尼沙門菌1株。其中，鼠傷寒沙門菌最多(59.87%，94/157)，腸炎沙門菌次之(16.56%，26/157)。

2.3耐藥基因分布 127株檢出耐藥基因，檢出率為80.89%(127/157)。7種耐藥基因中，檢出率由高到低依次是blaTEM(65.61%，103/157)、blaCTX-M(50.32%，79/157)、blaOXA-10(5.73%，9/157)、blaSHV(0.64%，1/157)，未檢出blaPER、blaCMY和blaACC。blaCTX-M分組基因中，以blaCTX-M-1G(n=46)和blaCTX-M-9G(n=33)多見，未檢出blaCTX-M-2G、blaCTX-M-8G和blaCTX-M-25G。

2.4鼠傷寒沙門菌和腸炎沙門菌的耐藥基因攜帶率比較 鼠傷寒沙門菌51株檢出blaCTX-M，其中blaCTX-M-1G攜帶率為27.66%(26/94)，blaCTX-M-9G攜帶率為26.60%(25/94)；腸炎沙門菌14株檢出blaCTX-M，均屬于blaCTX-M-1G，攜帶率為53.84%(14/26)。鼠傷寒沙門菌和腸炎沙門菌的blaCTX-M-1G和blaCTX-M-9G攜帶率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=6.285，P=0.012；χ2=8.735，P=0.003)。

2.5ESBLs確證試驗結(jié)果 157株沙門菌，80株產(chǎn)ESBLs，陽性率為50.96%。其中，鼠傷寒沙門菌ESBLs陽性率為54.26%(51/94)，腸炎沙門菌ESBLs陽性率為53.85%(14/26)。6株嬰兒沙門菌中，3株產(chǎn)ESBLs，3株不產(chǎn)ESBLs。80株ESBLs陽性沙門菌中，CTX耐藥、CAZ敏感或中介組20株，CTX和CAZ均耐藥組60株。77株ESBLs陰性沙門菌中，CTX耐藥、CAZ敏感或中介組3株，CAZ耐藥、CTX敏感或中介組54株，CTX和CAZ均耐藥組20株。

2.6ESBLs陽性和ESBLs陰性沙門菌耐藥基因分布特點 80株ESBLs陽性沙門菌中，28.75%檢出1種耐藥基因，主要為blaCTX-M-1G和blaCTX-M-9G；62.50%檢出2種耐藥基因，常見模式是blaCTX-M-1G+blaTEM(n=35)和blaCTX-M-9G+blaTEM(n=14)；8.75%檢出3種耐藥基因，以blaCTX-M-1G+blaTEM+blaOXA-10多見。77株ESBLs陰性沙門菌中，59.74%檢出1種耐藥基因，均為blaTEM；1株檢出2種耐藥基因；38.96%未檢出耐藥基因。ESBLs陽性菌株blaCTX-M和blaOXA-10的檢出率顯著高于ESBLs陰性菌株(P<0.05)，而兩組間blaTEM檢出率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表3。

表3 ESBLs陽性和ESBLs陰性沙門菌耐藥基因分布

2.7沙門菌表型與耐藥基因分布 根據(jù)表型分為3組：CAZ耐藥、CTX敏感或中介組(n=54)，CTX耐藥、CAZ敏感或中介組(n=23)及CAZ和CTX均耐藥組(n=80)。CAZ耐藥、CTX敏感或中介組只攜帶一種耐藥基因blaTEM，攜帶率22.93%(36/157)；CTX耐藥、CAZ敏感或中介組的沙門菌攜帶的耐藥基因模式以blaCTX-M-9G(n=8)和blaCTX-M-9G+blaTEM(n=7)多見；CAZ和CTX均耐藥組的沙門菌攜帶的耐藥基因模式以blaCTX-M-1G+blaTEM(n=35)最多。103株對CTX耐藥的沙門菌中，76.70%檢出blaCTX-M；54株對CTX不耐藥的沙門菌中，未檢出blaCTX-M，2組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=83.366，P=0.000)。134株對CAZ耐藥的沙門菌中，66.42%檢出blaTEM；23株對CAZ不耐藥的沙門菌中，60.87%檢出blaTEM，2組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.268，P=0.384)。blaTEM在3組中的攜帶率分別為66.67%、60.86%及66.25%，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.270，P=0.874)。

3 討論

沙門菌是全球常見的食源性腸道致病菌之一，其耐藥性與長期使用抗菌藥物有關(guān)。沙門菌的耐藥性與其所攜帶的耐藥基因密不可分。根據(jù)2019年中國細菌耐藥監(jiān)測網(wǎng)(CHINET)結(jié)果顯示，鼠傷寒沙門菌(n=636)和腸炎沙門菌(n=454)對CAZ的耐藥率分別為21.3%和11.5%[9]。沙門菌對β-內(nèi)酰胺類藥物耐藥的一個很重要的因素是產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶，尤其是ESBLs，常見的型別是blaTEM、blaCTX-M、blaOXA和blaSHV。本研究沙門菌blaTEM檢出率為65.61%，高于浙江余姚地區(qū)羅學(xué)輝等[10]報道的44.07%；blaCTX-M檢出率50.32%，高于羅學(xué)輝等[10]報道的27.12%、北京地區(qū)曲梅等[11]報道的7.38%；blaOXA檢出率為5.73%，明顯低于曲梅等[11]報道的12.30%。相較于羅學(xué)輝等[10]研究的沙門菌沒有經(jīng)過藥物的篩選和曲梅等[11]篩選用的藥物是青霉素類，本研究選取的是耐三代頭孢菌素的沙門菌，相關(guān)耐藥基因的檢出率可能會有所差異。耐CTX沙門菌blaCTX-M檢出率為76.70%，低于廣東地區(qū)姜琪等[12]報道的88.4%；blaSHV檢出率為0.97%，未檢出blaCMY，這和姜琪等[12]報道的未檢出blaSHV和blaCMY檢出率為21.4%亦有所不同，可能是2項研究分離的沙門菌存在地域和年份的差異，而且姜琪等[12]研究的是鼠傷寒沙門菌，這和本研究的沙門菌分布20種血清型也有差異。

本研究檢出blaOXA-10的沙門菌都表現(xiàn)出對CTX耐藥，和Jeon等[13]報道的blaOXA-10能夠降低沙門菌對CTX敏感性的觀點相似。80株ESBLs陽性沙門菌98.75%檢出blaCTX，邱玉鋒等[14]研究中10株ESBLs陽性沙門菌都檢出blaCTX，表明ESBLs陽性沙門菌的耐藥性主要由blaCTX介導(dǎo)。blaCTX耐藥基因可以通過水平傳播和垂直克隆擴增2種方式，使得blaCTX可以在不同細菌之間以及親代和子代之間廣泛傳播。77株ESBLs陰性沙門菌61.04%檢出blaTEM，和岳美娜等[15]關(guān)于blaTEM耐藥基因可能與ESBLs陰性沙門菌耐藥性相關(guān)的觀點相似。可能是blaTEM中blaTEM-1和blaTEM-2沒有超廣譜酶特征，對103株檢出blaTEM的沙門菌測序比對，是后續(xù)研究的一個方面。33.33%對CAZ耐藥和15%對CAZ和CTX均耐藥的沙門菌未檢出β-內(nèi)酰胺類耐藥基因，低于Yang等[16]的55%，這些對三代頭孢菌素耐藥的沙門菌其耐藥性可能由其他機制介導(dǎo)，例如外膜蛋白(OmpC和OmpF)的缺失和外排泵AcrAB-TolC的過表達[16]等。攜帶blaCTX-M的沙門菌均對CTX耐藥，類似于Park等[17]在韓國的研究結(jié)果，表明CTX耐藥和攜帶blaCTX-M耐藥基因之間有很高的符合度。然而，本研究中blaTEM耐藥基因的分布在CAZ耐藥和不耐藥的沙門菌中差異未見統(tǒng)計學(xué)意義，這些CAZ耐藥的菌株可能也由其他耐藥基因參與介導(dǎo)。

隨著頭孢菌素類藥物的大量使用，ESBLs和頭孢菌素酶(AmpC酶)已成為沙門菌對β-內(nèi)酰胺類藥物耐藥的2種主要滅活酶。由于β-內(nèi)酰胺酶類相關(guān)耐藥基因種類繁多，本研究僅選取其中研究較多的5種ESBLs基因和2種AmpC酶基因，難免造成表型耐藥沙門菌相關(guān)基因型的漏檢。沙門菌耐藥機制非常復(fù)雜，可能由于某些耐藥基因的高表達，或耐藥基因所在位置、遺傳結(jié)構(gòu)和幾種耐藥基因的協(xié)同作用以及其他耐藥機制共存等因素，表型和耐藥基因型并非遵循嚴格的對應(yīng)關(guān)系。近年來，高通量測序已經(jīng)成為一種經(jīng)濟快捷的研究手段，特別是在細菌研究方面應(yīng)用得越來越廣泛。后續(xù)研究希望能對這些沙門菌進行全基因組測序，不僅對耐藥基因有更詳細的研究，而且能對毒力系統(tǒng)和代謝系統(tǒng)進行更全面的研究。