不同核酸提取方法和新型冠狀病毒核酸檢測試劑室間質評結果分析*

余漢忠,牛璐璐,孔倩倩,李小川,蔡佩君,王麗

(1.中國礦業大學附屬醫院 徐州市第一人民醫院檢驗科, 江蘇徐州 221009；2.中國礦業大學化工學院, 江蘇徐州 221009)

2019新型冠狀病毒(2019 novel coronavirus，2019-nCoV)核酸檢測在疫情防控中至關重要。各廠家快速研發的各種核酸提取和檢測試劑盒并不穩定[1]，在檢測前需要進行充分的性能驗證及試劑比對，并積極開展實驗室間的室間質評比對活動，才能確保檢測結果的準確和可靠。本研究對徐州市第一人民醫院PCR實驗室采用的2種核酸提取方法和2種2019-nCoV核酸檢測試劑檢測室間質評樣本的結果進行比較分析，結果報道如下。

1 資料與方法

1.1樣本 2020年江蘇省臨床檢驗中心5月17日發放的2019-nCoV核酸檢測室間質量評價樣本5份(樣本號：209601、209602、209603、209604、209605)和2020年國家衛生健康委臨床檢驗中心6月17日發放的2019-nCoV核酸檢測室間質量評價樣本10份(樣本號：202001、202002、202003、202004、202005、202006、202007、202008、202009、202010)。

1.2儀器與試劑 SLAN-96P全自動熒光PCR儀(上海宏石公司)，AW-1000全自動核酸提取儀(江蘇碩世公司)；新型冠狀病毒(2019-nCoV)核酸檢測試劑盒(批號：20200302)、磁珠法核酸提取試劑盒(批號：SDK60105)源自江蘇碩世公司(A公司)，新型冠狀病毒(2019-nCoV)核酸檢測試劑盒(批號：2020076)、核酸釋放劑(批號：2020043)源自湖南圣湘公司(B公司)。

1.3方法 接收室間質評樣本當天即進行檢測。根據《新型冠狀病毒感染的肺炎實驗室檢測技術指南(第五版)》[2]要求進行生物安全防護。根據核酸提取和擴增試劑的不同，分為3種組合。組合1：A公司磁珠法核酸提取試劑+核酸檢測試劑，組合2：B公司核酸釋放劑+核酸檢測試劑，組合3：A公司磁珠法核酸提取試劑+B公司核酸檢測試劑。

1.3.1核酸提取 (1)磁珠法：用A公司核酸提取試劑盒及AW-1000全自動核酸提取儀，質評樣本充分混勻后，吸取200 μL加入相應深孔板第一列，放入提取儀，選擇相應程序自動提取；(2)核酸釋放劑法：八聯管中加入10 μL B公司樣本核酸釋放劑，質評樣本充分混勻后，吸取10 μL加入八聯管，充分混勻，靜置10 min。均按照試劑說明書進行。

1.3.2核酸擴增 用SLAN-96P全自動熒光PCR儀及核酸檢測試劑，根據試劑說明書配制反應體系并設置反應程序，進行擴增檢測及檢測結果判定。

A公司核酸檢測試劑PCR反應體系共25 μL，包括RT-PCR反應液7.5 μL，酶混合液5 μL，新冠三重反應液4 μL，去RNA酶H2O 3.5 μL，核酸模板樣本量5 μL。PCR擴增參數為：逆轉錄50 ℃ 30 min；預變性95 ℃ 5 min；變性95 ℃ 40 s，退火、延伸、測熒光55 ℃ 40 s，45個循環。結果判讀：FAM(ORF1ab)、ROX(N)、HEX(內標)3個通道Ct≤35且擴增曲線為S形曲線者，判定為該基因檢測結果為陽性；Ct>38判定為該基因檢測結果為陰性；35

B公司核酸檢測試劑的PCR反應體系共50 μL，包括RT-PCR反應液26 μL，酶混合液4 μL，核酸模板樣本量20 μL；PCR擴增參數為：逆轉錄50 ℃ 30 min；預變性95 ℃ 1 min；變性95 ℃ 15 s，退火、延伸、測熒光60 ℃ 30 s，45個循環；冷卻25 ℃ 10 s。結果判讀：FAM(ORF1ab)、ROX(N)、HEX(內標)3個通道Ct≤40且擴增曲線為S形曲線者判定為該基因檢測結果為陽性，Ct>40判定為該基因檢測結果為陰性，擴增曲線異常時需復查。

1.3.3質量控制 試劑盒自帶陰性和陽性對照，若陰性和陽性對照檢測結果在控，則該批次試驗結果有效；若陰性和陽性對照檢測結果不在控，則該批次試驗結果無效。設置環境評估樣本1個，為陰性對照開口放置于PCR實驗室Ⅱ區過夜，用質評樣本檢測方法檢測，評估有無環境污染。

2 結果

本實驗室根據標準操作規程進行操作后結果良好，陰性對照、陽性對照、環境評估樣本均在控制范圍內。根據國家衛生健康委臨檢中心和江蘇省臨床檢驗中心的室間質評結果回報，除209602、209604、202001、202006、202008號樣本為雙位點未檢出外，其余室間質評樣本均為雙位點陽性。3種試劑組合對陰性質評樣本均為未檢出，陰性結果符合率均為100%，對陽性質評樣本各基因的檢出結果見表1。

3 討論

準確的2019-nCoV病原鑒定對新型冠狀病毒肺炎疑似患者治療方案的確定、感染的控制都發揮著關鍵作用[3-4]。本研究選取了徐州市第一人民醫院現在使用的2種2019-nCoV核酸檢測試劑及2種提取方法對室間質評樣本進行分析。從實驗結果可以看出，磁珠法提取的核酸用A和B公司核酸檢測試劑檢測的有效檢出率都能達到100%。但B公司核酸釋放劑法提取后的核酸使用B公司核酸檢測試劑對陽性質評樣本ORF1ab基因的檢出率為70%，N基因檢出率為90%，說明核酸提取效果不佳。而磁珠法提取的核酸再用B公司核酸檢測試劑檢測質評樣本的結果表明，所有陽性樣本的Ct值均小于其他2種組合，說明此試劑組合對室間質評陽性樣本均能更靈敏地檢出靶基因[5]。

本實驗僅對2種某一批號的試劑用國家衛健委臨檢中心和江蘇省臨床檢驗中心的室間質評樣本作了簡單的比較分析，因為樣本量較少，可能并不代表2種試劑的整體檢測能力。目前國內疫情放緩，研究對象缺乏，若能獲取大數量的陽性樣本，可以對不同提取和擴增試劑進行更全面的評價。