補腎活血方對AGEs/缺氧條件下視網膜Müller 細胞PEDF 及VEGF 的影響

馬殿偉，謝學軍，盧靜，張梅

糖尿病視網膜病變（diabetic retinopathy，DR）是糖尿病最常見的微血管并發癥，發病機制復雜，傳統的激光和手術治療效果均不理想。因此，開發新的治療策略預防和治療DR 是至關重要的。研究[1]表明，色素上皮衍生因子（pigment epithelium-derived factor，PEDF）是一種內源性的神經營養因子，具有神經營養活性、抑制新生血管、抗血管通透性[2]、抗炎[3]、抗纖維化[4]和抗癌[5-6]等作用，在探索DR 新的治療手段的研究上有重要意義。

糖尿病是以體內糖代謝紊亂為主要特征，引起細胞因子、血流動態異常，在視網膜主要表現為微小血管閉塞、缺血，以新生血管形成為主體的病變。視網膜微血管病變進一步導致視網膜缺血缺氧[7-9]，同時高血糖和隨后增強的晚期糖基化終產物（advanced glycosylation end products，AGEs）的積累，引起視網膜多種細胞凋亡及功能紊亂，促進DR 進程[10-13]；過量的AGEs 又會促進產生血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）及其mRNA 的表達以及毛細血管內皮細胞的滲漏，這些反應進一步加重視網膜缺氧狀態。

視網膜Müller 細胞幾乎包裹所有視網膜神經元，并與視網膜血管緊密連接，這種生理結構有助于血-視網膜內屏障（inner Blood Retinal Barrier，iBRB）的緊密連接功能[14]，說明視網膜Müller 細胞功能障礙對于視網膜神經變性與微血管異常似乎起著關鍵作用[15]。同時視網膜Müller 細胞能夠產生調節血流，血管通透性和細胞存活的生物因子起到保護視神經作用，其中的PEDF 及相關因子可能就是視網膜Müller 細胞釋放的主要神經保護劑之一[16]。前期的實驗[17]均表明，補腎活血方具有保護糖尿病視網膜Müller 細胞及調控相關細胞因子的作用，故本文擬討論補腎活血方對AGEs/缺氧條件下視網膜Müller細胞分泌的PEDF 及相關因子的研究。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

新生7 d SD 大鼠5 只（視網膜Müller 細胞培養取材，雌雄不限，雙眼未睜）及8～12 周齡SD 大鼠20只（制備血清，雌雄各半，體重120～150 g），清潔級，均符合國家醫用動物一級動物使用標準，由成都中醫藥大學動物實驗中心提供（生產合格證：川實動管質第99-11 號）。

1.2 試劑與儀器

大鼠血VEGF、PEDF/ELISA 試劑盒（北京麗科）；連二亞硫酸鈉（分析純）（重慶西南化學試劑廠）；胰蛋白酶（Gibico 公司）；PBS 緩沖液（北京中杉公司）；DMEM 培養基（成都科比特公司）；酶聯免疫檢測儀（美國寶特Bio-Tek）。

1.3 實驗藥物

補腎活血復方中藥浸膏（成都中醫藥大學藥學院制劑室），藥物組成：人參、熟地黃、川芎、牡丹皮等。

1.4 方法

1.4.1 視網膜Müller 細胞原代的培養 實驗方法與前期實驗[18]相同：（1）出生后第7 d 的SD 大鼠5只（同窩乳鼠），頸脫位法處死，無菌條件下快速取出眼球，用75%乙醇浸泡15 min，含有雙抗的PBS 緩沖液沖洗3 次，放于適量無血清的DMEM 液中。（2）將其放置在室溫下，避光保存過夜（12 h）。（3）用吸管將無血清DMEM 液移出，然后PBS 緩沖液對眼球組織進行沖洗，甩干，每10 只眼球加入0.25%胰蛋白酶5 ml，置于恒溫培養箱中進行組織消化，時間1 h。（4）用吸管將胰蛋白酶移除，并將含20%胎牛血清的DMEM 液加入盛放組織的培養瓶中，其目的是終止胰蛋白酶對組織的消化。（5）使用體視顯微鏡，剪掉角膜，用顯微鑷輕輕去掉其中的晶狀體和玻璃體，將視網膜剝離出來。用吸管將所有視網膜移至離心管中，輕輕吹打，使組織成乳糜狀后，將沉淀細胞用培養基散布并接種在培養瓶中，每3 d 更換1 次培養基，每天觀察細胞生長情況。（6）傳代培養：約5 d細胞達到80%融合時，將培養液移除，用PBS 緩沖液沖洗3 次，將5 ml 0.25%胰蛋白酶加入其中用以消化，于37℃培養箱，在離心管裝好DMEM 液備用（終止消化用），20 min 后取出培養瓶，用吸管小心吹打消化后的組織，然后吸入備用的離心管中，1000 r/min離心10 min，將上清液移除。將少量DMEM 液加入離心管，再用吸管輕輕吹打沉淀物使混合均勻，從中取1 滴細胞懸液計數，適當調整培養液量，將使細胞密度調整至為1×106/ml，取3ml/瓶放入培養瓶，繼續放在5%CO2，37℃培養箱中培養。

1.4.2 血清的制備 用補腎活血中藥組大鼠（每日9 時給予補腎活血復方中藥浸膏灌胃1 次，給藥劑量為11.67 g/kg/d，連續7 d。）及對照組大鼠（每日相同時間給予等劑量的生理鹽水）所制備的SD 大鼠血清分別簡稱中藥含藥血清、空白血清，方法與前期實驗[18]相同。分離的血清以56℃，30 min 滅活處理用，0.22 μm微孔濾膜過濾除菌、5 ml 分裝，-20℃保存備用。

1.4.3 細胞分組與處理[18-21]將第2 代視網膜Müller 細胞接種在96 孔培養板中，密度為2×104個/ml，每孔200 μl，共3 板；24 h 后，將含有體積分數20%胎牛血清的DMEM 培養液棄掉，換用無血清的培養液以排除胎牛血清干擾，孵育24 h 后，棄掉無血清的培養液，按下列分組情況換含有不同培養條件的培養液，將3 個板隨機標記為24 h、48 h、72 h，放入培養箱繼續培養，分別于24 h、48 h、72 h 測定實驗指標。

正常對照組（NC 組）：DMEM 培養基（20%空白血清）；正常中藥干預組（NCM 組）：DMEM 培養基（20%中藥含藥血清）；低AGEs 組（LA 組）：DMEM培養基（20%空白血清）+AGEs（終濃度為50 mg/L）；高AGEs 組（HA 組）：DMEM 培養基（20%空白血清）+AGEs（終濃度為100 mg/L）；低AGEs 中藥干預組（LAM 組）：DMEM 培養基（20%中藥血清）+AGEs（終濃度為50 mg/L）；高AGEs 中藥干預組（HAM組）：DMEM 培養基（20%中藥血清）+AGEs（終濃度為100 mg/L）；模擬缺氧組（SH 組）：DMEM 培養基（20%空白血清）+Na2S2O2（終濃度為1 mg/L）；模擬缺氧中藥干預組（SHM 組）：DMEM 培養基（20%中藥血清）+Na2S2O2（終濃度為1 mg/L）。

1.5 ELISA 法檢測細胞培養液中VEGF、PEDF 含量

采用雙抗體夾心法來測定細胞培養液上清液中大鼠VEGF/PEDF 水平。用ELISA 試劑盒純化的大鼠VEGF/PEDF 抗體包被微孔板，制作固相抗體，向包被單抗的微孔內依次加入大鼠VEGF/PEDF，然后與HRP 標記的大鼠VEGF/PEDF 抗體結合，形成抗體-抗原-酶標抗體復合物，徹底洗滌后將底物TMB加入其中以顯色。HRP 酶催化TMB 變成藍色，酸的作用將使其轉化為黃色。其顯示顏色的深淺和樣品中的大鼠VEGF/PEDF 呈正相關。在450 nm 波長下用酶標儀測定其吸光度（optical density，OD）值，然后用標準曲線計算細胞培養液上清液（50 μl）中大鼠VEGF、PEDF 的濃度。

計算方法：以標準物的濃度為橫坐標，OD 值為縱坐標，在坐標紙上繪出標準曲線，用標準物的濃度與OD 值計算出標準曲線的直線回歸方程式，將細胞培養液的OD 值代入方程式，計算出細胞培養液濃度，再乘以稀釋倍數，即為細胞培養液的實際濃度。

1.6 統計學方法

數據采用統計軟件SPSS 22.0 進行整理分析，計量資料采用均數±標準差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t 檢驗，同組間的比較采用配對樣本t 檢驗，P<0.05 為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 純化培養視網膜Müller 細胞鑒定結果

視網膜Müller 細胞的胞體呈狹長肥大狀，可見扇形細胞，胞漿豐富，淺紅色；胞核大，位于胞體中央，染色淡，2 個或2 個以上核仁（圖1）。

圖1 視網膜Müller 細胞形態圖（×100 倍）。1A 原代視網膜Müller細胞；1B 視網膜Müller 細胞的HE 染色；1C 視網膜Müller 細胞的GFAP 染色；1D 視網膜Müller 細胞的GS 染色

2.2 視網膜Müller 細胞VEGF 表達量

同時段組間比較：（1）24、48、72 h 時，SH 組、LA組、HA 組視網膜Müller 細胞VEGF 表達量均高于NC 組，差異均有統計學意義（P＜0.05）；HA 組、SH 組表達量均高于LA 組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。（2）24 h 時，SH 組表達量高于HA 組；48 h 時，SH 組表達量低于HA 組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。（3）除72 h NCM 組VEGF 表達量與NC 組相比，差異無統計學意義（P＞0.05）外，其余時段有中藥干預組的表達量均較對應無中藥干預組降低，差異均有統計學意義（P＜0.05）。

不同時間段組內比較：SH 組（t48h=-9.25，P=0.000；t72h=-37.20，P=0.000）、LA 組（t48h=-2.99，P=0.030；t72h=-2.65，P=0.045）、HA 組（t48h=-3.22，P=0.023；t72h=-3.02，P=0.029）、LAM 組（t48h=-56.93，P=0.000；t72h=-10.65，P=0.000）、HAM 組（t48h=58.12，P=0.000；t72h=-19.23，P=0.000）、SHM 組（t48h=-89.91，P=0.000；t72h=-8.02，P=0.000），VEGF 表達量均較前一時段增高，差異均有統計學意義（表1、2）。

表1 不同模型條件下視網膜Müller 細胞VEGF 表達量（，n=6）

表1 不同模型條件下視網膜Müller 細胞VEGF 表達量（，n=6）

注：▲同時段與NC 組比較，P<0.05；● 同時段與LA 組比較，P<0.05；▼ 同時段與HA 組比較，P<0.05；■ 同時段與SH 組比較，P<0.05；★同組內與前一時間段比較，P<0.05

表2 不同模型條件下視網膜Müller 細胞VEGF表達量統計值

2.3 視網膜Müller 細胞PEDF 表達量測定

同時段組間比較：（1）SH 組、LA 組、HA 組各個時段視網膜Müller 細胞PEDF 表達量較NC 組降低，差異均有統計學意義（P＜0.05）。（2）24、72 h 時，HA 組、SH 組PEDF 表達量較LA 組降低，差異均有統計學意義（P＜0.05）。（3）24 h 時，SH 組PEDF 表達量較HA 組降低，差異有統計學意義（P＜0.05）。（4）24、72 h NCM 組、LAM 組，24、48、72 h HAM 組，24 h SHM 組視網膜Müller 細胞PEDF 表達量均較對應無中藥干預組增高，差異有統計學意義（P＜0.05）。

不同時間段組內比較：LA 組（t48h=8.55，P=0.000；t72h=27.85，P=0.000）、HA 組（t48h=32.10，P=0.000；t72h=56.16，P=0.000）、SH 組（t48h=9.45，P=0.000；t72h=9.97，P=0.000）、LAM 組（t48h=11.06，P=0.000；t72h=29.39，P=0.000）、HAM 組（t48h=13.33，P=0.000；t72h=29.92，P=0.000）、SHM 組（t48h=8.84，P=0.000；t72h=13.69，P=0.000）細胞PEDF 表達量均較前一時段降低，差異均有統計學意義（表3、4）。

表3 不同模型條件下視網膜Müller 細胞PEDF 表達量（，n=6）

表3 不同模型條件下視網膜Müller 細胞PEDF 表達量（，n=6）

注：▲同時段與NC 組比較，P<0.05；● 同時段與LA 組比較，P<0.05；▼ 同時段與HA 組比較，P<0.05；■ 同時段與SH 組比較，P<0.05；★同組內與前一時間段比較，P<0.05

表4 不同條件下視網膜Müller 細胞PEDF 表達量比較統計值

2.4 視網膜Müller 細胞VEGF 與PEDF 蛋白濃度的比值

本實驗顯示：（1）NC 組、NCM 組各時段其比值幾乎相同，表明視網膜Müller 細胞VEGF 與PEDF的量處于相對平衡的狀態。（2）LA 組、HA 組、SH組、LAM 組、HAM 組、SHM 組各時間點其比值較NC組均有不同程度的升高。（3）LA 組、HA 組、SH 組比值均隨著時間的延長而升高；LAM 組、HAM 組、SHM 組比值均隨著時間的延長而升高，但較之LA組、HA 組、SH 組，其升高幅度降低（表5）。

表5 VEGF 與PEDF 比值（，n=6）

表5 VEGF 與PEDF 比值（，n=6）

3 討論

血管異常增生是DR 的主要病理基礎，有研究[22]發現PEDF 可以抑制這種異常的血管增生。PEDF的穩定表達對于維持視網膜正常功能及結構、血管通透性及新生血管的生成十分重要[23]。本實驗提示，缺氧、低AGEs、高AGEs 可以導致視網膜Müller 細胞PEDF 蛋白的表達量降低，而補腎活血方使正常條件下體外純化培養的視網膜Müller 細胞PEDF 蛋白的分泌在24 h 及72 h 增高，可以使缺氧、低AGEs、高AGEs 導致的視網膜Müller 細胞PEDF 蛋白表達降低幅度減小。補腎活血方對于病理狀態下Müller 細胞能夠釋放具有保護作用的細胞因子PEDF，可在一定程度上糾正病理條件下PEDF 因子的異常表達，這可能是補腎活血法防治DR 的一個重要的途徑。

有研究[24]表明，視網膜Müller 細胞來源的VEGF能夠刺激血管內皮細胞的增殖、遷移和成管，從而導致新血管的生成參與了由糖尿病誘導的視網膜血管病變，VEGF 蛋白的表達量升高。補腎活血方使正常條件下體外純化培養的視網膜Müller 細胞VEGF 蛋白的分泌在24 h 及48 h 降低；補腎活血中藥血清對高AGEs、低AGEs、缺氧條件下視網膜Müller 細胞VEGF 的過表達有抑制作用，說明補腎活血中藥含藥血清的加入可以刺激病理狀態下Müller 細胞釋放PEDF，抑制視網膜Müller 細胞VEGF 的過表達，這可能是補腎活血法防治DR 的藥物干預途徑之一。

在生理條件下，PEDF 和VEGF 之間存在平衡關系，PEDF 可以抑制VEGF 的血管生成潛力[25]。血管生成的穩態受兩種反平衡系統的調節：血管生成刺激劑和血管生成抑制劑。這種平衡對血管生成的調節至關重要[26]。有研究[27]證明，在缺血誘導的視網膜新血管形成大鼠模型中VEGF 增加和PEDF 降低，導致更高的VEGF/PEDF 比率，PEDF 下調的時間過程與VEGF 表達增加一致，即最高VEGF 水平與最低PEDF 水平一致，VEGF/PEDF 比率變化的時間過程與視網膜新血管形成的發展和進展相關。本實驗顯示：正常情況下，各時段視網膜Müller 細胞所分泌的PEDF 和VEGF 比值基本維持恒定，二者處于相對平衡的狀態；正常中藥干預組，各時段的比值均稍低于正常對照組，但各時段比值基本恒定，二者同樣處于相對平衡的狀態；缺氧、低AGEs、高AGEs 組VEGF/PEDF 比值，在各時段均高于正常對照組，并隨著時間的延長不斷增大；補腎活血中藥復方含藥血清可減輕在AGEs（終濃度50 mg/L 和100 mg/L）以及缺氧條件下VEGF 與PEDF 的不平衡，這可能是其防治DR 的一個重要作用機制。

本實驗中，正常對照組視網膜Müller 細胞所分泌的VEGF 與PEDF 表達量變動方向一致，提示在僅有視網膜Müller 細胞環境中，血管生成刺激劑的代表—VEGF 與血管生成抑制劑的代表—PEDF 仍然處于平衡狀態。Bussolino 等研究[26]證實，血管生成的穩態受兩種反平衡系統的調節—血管生成刺激劑和血管生成抑制劑，這種平衡對血管生成的調節至關重要。因此，筆者推測視網膜Müller 細胞分泌的VEGF 與PEDF 的這種平衡可能對血管生成的調節也同樣至關重要。本實驗中，高AGEs 組的VEGF與PEDF 表達量變動方向相反，其二者間的平衡不僅被打破，而且呈現出VEGF 表達增加的程度與PEDF 下調的程度一致。Gao 等[27]曾報道在缺血誘導的視網膜新血管形成大鼠模型中VEGF 增加和PEDF 降低，導致更高的VEGF/PEDF 比率，PEDF 下調的時間過程與VEGF 表達增加一致，VEGF/PEDF比率變化的時間過程與視網膜新血管形成的發展和進展相關。因此，筆者推測在終濃度為100 mg/L的AGEs 條件下，視網膜Müller 細胞呈現出VEGF表達增加的程度與PEDF 下調的程度一致提示視網膜Müller 細胞VEGF 與PEDF 處于嚴重的失衡狀態。本實驗中，低AGEs 組、模擬缺氧組以及低AGEs+中藥干預組、模擬缺氧+中藥干預組的VEGF與PEDF 表達量變動均無明顯的相關性，提示在模擬缺氧以及終濃度為50 mg/L 的AGEs 條件下VEGF 與PEDF 之間的平衡雖然也被打破，但是尚未出現VEGF 表達增加的程度與PEDF 下調的程度一致的情況，即在本實驗中的模擬缺氧以及終濃度為50 mg/L 的AGEs 條件下視網膜Müller 細胞VEGF 與PEDF 失衡狀態沒有在終濃度為100 mg/L的AGEs 條件下嚴重；同時也提示補腎活血中藥復方雖然能夠降低VEGF 與PEDF 的比值，但是尚未能恢復VEGF 與PEDF 的平衡狀態。高AGEs 組與高AGEs+中藥干預組相比，發現補腎活血中藥復方能降低VEGF 與PEDF 的比值、減輕在終濃度為100 mg/L 的AGEs 條件下視網膜Müller 細胞VEGF與PEDF 的嚴重失衡狀態。因此，補腎活血中藥復方含藥血清可減輕在AGEs（終濃度50mg/L 和100mg/L）以及缺氧條件下VEGF 與PEDF 的失衡狀態可能是其防治DR 的一個重要作用機制。