滇重樓地上部分總皂苷HPLC指紋圖譜△

蔣維，李小輝，萬近福，*，梅雙喜，付小云

1.昆明醫科大學 藥學院/云南省天然藥物藥理重點實驗室，云南 昆明 650500；2.云南省藥物研究所，云南 昆明 650111；3.云南白藥集團創新研發中心，云南 昆明 650111；4.云南省中藥和民族藥新藥創制企業重點實驗室，云南 昆明 650111

重樓Paridis Rhizoma是百合科重樓屬植物，以云南、四川、貴州、福建等地的種類和資源最為豐富，主要有滇重樓ParispolyphyllaSmith var.yunnanensis(Franch.) Hand.-Mazz、七葉一枝花P.polyphyllaSmith var.chinensis(Franch.) Hara、多葉重樓P.polyphyllaSm.var.polyphylla、華重樓P.polyphyllavar.chinensis(Franch.) Hara、狹葉重樓P.polyphyllavar.stenophyllaFranch.、花葉重樓P.marmorataStearn等多個品種。重樓作為傳統中藥材，藥用歷史悠久，一直以根莖入藥，具有清熱解毒、消腫止痛和涼肝定驚的功效。《中華人民共和國藥典》(以下簡稱《中國藥典》)2020年版收載的品種為滇重樓和七葉一枝花[1-2]。現代藥理研究表明，重樓主要活性成分為甾體皂苷類化合物，具有較強的抗腫瘤、修復胃黏膜損傷、誘導血小板聚集和子宮平滑肌收縮的活性。重樓每年都可再生的地上部分一直被認為是非藥用部位而被丟棄，至今未被開發利用。為了充分利用重樓地上部分植物資源，已有學者對重樓地上部位開展了化學成分及藥理作用研究，證明了皂苷類成分是重樓地上部分的主要活性成分[3-4]，地上部分比根莖含有更多的皂苷元，尤其是C-22內酯和紐替皂苷元(nuatigenin)只在地上部分檢測到。但重樓地上部分和根莖中均含有《中國藥典》2020年版重樓“含量測定”項下的重樓皂苷Ⅰ、重樓皂苷Ⅱ和重樓皂苷Ⅶ等成分，說明其皂苷類成分相似但不完全相同，具有開發價值[5]。為了更好地開發和利用重樓地上部分，本研究采用高效液相色譜法(HPLC)建立滇重樓地上部分總皂苷的指紋圖譜，并進行滇重樓地上部分、地下部分特征圖譜比對，為重樓地上部分總皂苷的有效質量控制及重樓地上部分的開發利用和深入研究提供參考。

1 材料

1.1 試藥

干燥滇重樓地上部分由云南白藥武定種植基地提供，由云南白藥集團趙庭周高級工程師鑒定，為滇重樓ParispolyphyllaSmith var.yunnanensis(Franch.) Hand.-Mazz。

滇重樓地上部分總皂苷為自制，包括3批中試實驗制備樣品(批號分別為20190805、20190812、20190819，編號分別為S1～S3)和3批放大實驗制備樣品(批號分別為20190616-1、20190616-2、20190616-3，編號分別為S4～S5)；對照品重樓皂苷Ⅰ、重樓皂苷Ⅱ、重樓皂苷Ⅵ、重樓皂苷Ⅶ(批號：11590-201604)均購自中國食品藥品檢定研究院，純度均大于94.0%；對照品重樓皂苷Ⅲ、重樓皂苷Ⅳ、重樓皂苷Ⅴ、重樓皂苷PA、重樓皂苷H為實驗室自制，標定純度>99.2%。

柱色譜洗脫試劑三氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇、乙醇為工業純重蒸(國藥集團化學試劑有限公司)；顯色劑用10%硫酸乙醇溶液；水為自制超純水；乙腈(色譜純，Merck公司)；甲醇、無水乙醇(分析純，國藥集團化學試劑有限公司)。

1.2 儀器

UltiMate 3000型高效液相色譜儀，包括LC-20AT型四元泵、SIL-20A型自動進樣儀、CTO-20A型柱溫箱、SPDM20A型紫外檢測器(美國賽默飛世爾公司)；AG-285型電子分析天平[Mettler-Toledo(上海)有限公司]；SK8200HP型超聲波清洗器(上海科導超聲儀器有限公司)；超純水器(美國Millipore公司)；VG Auto Spec-3000型質譜儀(美國賽默飛世爾公司)；DRX-400型核磁共振儀(德國Bruker公司)。

柱色譜硅膠(80～100、200～300目)和薄層色譜硅膠G板、HPD-100型大孔樹脂(青島海洋化工有限公司)；十八烷基鍵合硅膠Rp-C18(40～63 μm，Merck公司)。

2 方法與結果

2.1 總皂苷制備

重樓藥材(粉碎、過篩)粗粉用60%乙醇回流提取3次(共14倍量)，離心得到提取液，提取液50 ℃減壓濃縮得到濃縮液，濃縮液再用HPD-100型大孔樹脂柱色譜純化(先后用40%、85%乙醇洗脫)，收集85%流分減壓濃縮、真空干燥，即得。

2.2 色譜條件

采用Ecosil HPLC C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)進行分離，流動相為乙腈(A)-水(B)溶液，梯度洗脫(0～10 min，40%A；10～30 min，40%～50%A；30～32 min，50%～40%A；32～35 min，40%A)；流速為1.0 mL·min-1；檢測波長為203 nm；柱溫為31 ℃；進樣量為10 μL；檢測時間為35 min。

2.3 溶液的制備

2.3.1混合對照品溶液 取重樓皂苷Ⅰ、重樓皂苷Ⅱ、重樓皂苷Ⅲ、重樓皂苷Ⅳ、重樓皂苷Ⅴ、重樓皂苷Ⅵ、重樓皂苷Ⅶ、重樓皂苷PA、重樓皂苷H對照品適量，加甲醇制成含重樓皂苷Ⅰ 72.97 μg·mL-1、重樓皂苷Ⅱ 82.92 μg·mL-1、重樓皂苷Ⅲ 75.30 μg·mL-1、重樓皂苷Ⅳ 72.40 μg·mL-1、重樓皂苷Ⅴ 64.70 μg·mL-1、重樓皂苷Ⅵ 61.30 μg·mL-1、重樓皂苷Ⅶ 66.30 μg·mL-1、重樓皂苷PA 68.50 μg·mL-1、重樓皂苷H 72.40 μg·mL-1的混合對照品溶液，即得。

2.3.2供試品溶液 取各批次總皂苷試藥約0.15 g，精密稱定，置于10 mL量瓶中，加85%乙醇水使溶解、定容，搖勻，用微孔濾膜(0.45 μm)濾過，取續濾液，即得。

2.4 方法學考察

2.4.1精密度試驗 取同一供試品溶液S1(批號：20190805)，連續進樣6次，檢測特征圖譜，選擇出峰穩定、峰面積較大、響應值最高的重樓皂苷Ⅶ為參照峰，各色譜峰相對保留時間的RSD均小于0.26%，相對峰面積的RSD均小于1.81%，表明本方法精密度良好。

2.4.2重復性試驗 取同一供試品S1(批號：20190805)6份，按2.3.2項下方法平行制備6份供試品溶液，按2.2項下色譜條件檢測，記錄特征圖譜，以重樓皂苷Ⅶ為參照峰，計算主要色譜峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD，結果表明，各色譜峰相對保留時間的RSD均小于0.31%，相對峰面積的RSD均小于1.02%，表明該分析方法重復性良好。

2.4.3穩定性試驗 取同一供試品溶液S1(批號：20190805)分別于0、2、4、6、8、12 h進行檢測，記錄特征圖譜，以重樓皂苷Ⅶ為參照峰，各色譜峰相對保留時間的RSD均小于0.97%，相對峰面積的RSD均小于1.22%，表明供試品溶液在12 h內穩定。

2.5 指紋圖譜的建立

將6批重樓地上部分總皂苷樣品分別按2.3.2項下方法制成供試品溶液，按2.2項下色譜條件進樣分析，得到各樣品的HPLC特征圖譜。將6批樣品的特征圖譜以CDF格式依次導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統”(2012版)，以S1樣品圖譜為參照圖譜，采用中位數法，時間窗寬度為0.10 min，對色譜峰進行多點校正后，自動匹配，生成對照圖譜(R)，見圖1。共標定8個共有峰，6批所測供試品色譜圖與對照圖譜相似度均大于0.99。結果表明，不同批次的重樓地上部分總皂苷的化學組成十分相似。

圖1 6批重樓地上部分總皂苷特征圖譜和對照圖譜(R)

2.6 特征圖譜中未知化合物分離鑒定

2.6.1化合物分離 取3批中試重樓地上部分總皂苷各200 g，共600 g，85%乙醇水溶解，1200 g硅膠拌樣。粗分劃段：試藥用硅膠柱色譜(乙酸乙酯-乙醇，100∶1～10∶1)梯度洗脫，得到目標峰化合物含量較高的G、F組分；G組分用硅膠柱色譜(三氯甲烷-甲醇，20∶1～5∶1，)梯度洗脫，再經中壓Rp-C18柱色譜(75%～100%甲醇)洗脫，得到2個亞組分，再分別重結晶、濾過結晶、收集母液再重結晶得化合物cld01(3 g)和化合物cld03(1.5 g)；F組分用硅膠柱色譜(三氯甲烷-甲醇，20∶1～5∶1，)梯度洗脫，再用中壓Rp-C18柱色譜(75%～100%甲醇)，得到1個亞組分，經重結晶、濾過結晶、收集母液再重結晶得化合物cld02(100 mg)。

2.6.2結構鑒定cld01：白色針狀結晶(甲醇)。ESI-MSmz：883[M-H]-，929[M+HCOO]-；分子式為C45H72O17。1H-NMR(500 MHz，CD3OD)δ：5.31(1H，brd，J=5.0 Hz，H-6)，4.45(lH，dd，J=5.5，5.0 Hz，H-16)，3.85(1H，m，H-3)，3.51(2H，m，H-26)，2.28(lH，q，J=7.0 Hz，H-20)，1.23(3H，d，J=7.0 Hz，Me-21)，0.97(3H，s，Me-18)，0.95(3H，s，Me-19)，0.69(3H，d，J=5.5 Hz，Me-27)；13C-NMR(125 MHz，CD3OD)δ：37.6(C-1)，30.2(C-2)，78.1(C-3)，39.3(C-4)，142.0(C-5)，122.1(C-6)，32.4(C-7)，32.3(C-8)，50.1(C-9)，37.0(C-10)，21.3(C-11)，32.1(C-12)，45.1(C-13)，53.1(C-14)，31.8(C-15)，90.1(C-16)，90.0(C-17)，17.3(C-18)，19.7(C-19)，44.9(C-20)，9.2(C-21)，110.5(C-22)，32.1(C-23)，29.0(C-24)，30.5(C-25)，66.9(C-26)，17.4(C-27)；glc：102.5，75.6，76.5，77.7，77.2，61.5；rha′：102.4，73.4，73.0，80.0，68.3，18.6；rha″：103.1，72.6，72.9，74.0，70.4，17.9。以上數據與文獻報道基本一致，故鑒定化合物cld01為偏諾皂苷元-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→4)-[α-L-吡喃鼠李糖基-(1→4)]-β-D-吡喃葡萄糖苷{pennogenin-3-O-α-L-rhamnopyranosyl(1→4)-[α-L-rhamnopyranosyl(1→4)]-β-D-glucopyran oside}[6]，結構見圖2。

cld01：R1=OH，R2=S1cld02：R1=OH，R2=S2cld03：R1=H，R2=S1S1 =α-L-rha-(1→4)-α-L-rha-(1→4)-β-D-glc-S2 =α-L-rha-(1→4)-β-D-glc-圖2 化合物cld01～cld03結構

cld02：白色無定型粉末。ESI-MSmz：761[M+Na]+，分子式為C39H62O13。1H-NMR(500 MHz，CDCl3)δ：4.84(2H，s，H-16)，4.39(1H，d，J=8.0 Hz，H-17OH)，3.97(2H，ddt，J=18.5，9.5，6.5 Hz，H-26)，3.85～3.71(2H，m，H-3)，2.21(1H，q，J=7.0 Hz，H-20)，1.20(3H，d，J=7.0 Hz，Me-21)，0.97(3H，s，Me-18)，0.95(3H，s，Me-19)，0.69(3H，d，J=5.5 Hz，Me-27)；13C-NMR(125 MHz，CDCl3)δ：37.9(C-1)，30.4(C-2)，78.0(C-3)，39.6(C-4)，141.9(C-5)，122.0(C-6)，32.5(C-7)，31.7(C-8)，51.0(C-9)，37.6(C-10)，21.5(C-11)，32.1(C-12)，45.7(C-13)，53.6(C-14)，31.3(C-15)，90.4(C-16)，91.0(C-17)，17.5(C-18)，19.8(C-19)，45.0(C-20)，9.2(C-21)，110.5(C-22)，32.5(C-23)，29.4(C-24)，30.7(C-25)，67.0(C-26)，17.8(C-27)；glc：102.4，75.2，76.7，79.0，77.0，61.9；rha：102.9，72.4，72.9，73.9，70.6，18.0。以上數據與文獻報道基本一致，故鑒定化合物cld02為偏諾皂苷元-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖苷[pennogenin-3-O-α-L-rhamnopyranosyl(1→4)-β-D-glucopyranoside)][7]，結構見圖2。

cld03：白色針狀結晶(甲醇)。ESI-MSm/z：867[M-H]-，913[M+HCOO]-，分子式為C45H72O16。1H-NMR(500 MHz，MeOD)δ：5.37(1H，dt，J=5.5，2.0 Hz，H-6)，5.17(1H，d，J=2.0 Hz，H-17)，4.84(1H，d，J=12.0 Hz，H-8)，4.57(1H，s，H-6)，4.39(2H，t，J=7.0 Hz，H-16)，3.95～3.89(1H，m，H-2)，2.30～2.20(1H，m，H-1)，1.20(3H，d，J=7.0 Hz，Me-21)，0.97(3H，s，Me-18)，0.95(3H，s，Me-19)，0.69(3H，d，J=5.5 Hz，Me-27)；3C-NMR(125MHz，MeOD)δ：37.9(C-1)，29.8(C-2)，76.7(C-3)，38.5(C-4)，141.9(C-5)，122.5(C-6)，32.5(C-7)，31.3(C-8)，51.5(C-9)，38.0(C-10)，21.9(C-11)，39.5(C-12)，40.9(C-13)，57.5(C-14)，32.6(C-15)，80.3(C-16)，61.9(C-17)，16.4(C-18)，19.7(C-19)，41.4(C-20)，14.9(C-21)，110.0(C-22)，31.3(C-23)，28.5(C-24)，30.5(C-25)，66.1(C-26)，17.5(C-27)；glc：102.5，75.3，76.7，78.9，77.0，61.9；rha′：102.4，72.9，73.7，80.6，67.9，19.7；rha″：103.2，72.9，73.0，73.9，70.4，18.5。以上數據與文獻報道基本一致，故鑒定化合物cld03為薯蕷皂苷元-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→4)-[α-L-吡喃鼠李糖基-(1→4)]-β-D-吡喃葡萄糖苷{diosgenin-3-O-α-L-rhamnopyranosyl(1→4)-[α-L-rhamnopyranosyl(1→4)]-β-D-glucopyrano side)}[8]，結構見圖2。

2.6.3共有峰的歸屬及指認 分別取供試品溶液(S1)、9個重樓皂苷混合對照品溶液和分離得到的cld01～cld033個單體化合物加甲醇溶解制成的3個對照品溶液，按2.2項下色譜條件進樣分析，記錄色譜圖，見圖3～4。參照12個對照品的色譜行為及其二極管陣列(DAD)檢測紫外光譜圖，在圖3上對各色譜峰進行指認，確認了7個成分，即重樓皂苷Ⅶ(2號峰)、重樓皂苷PA(3號峰)、偏諾皂苷元-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→4)-[α-L-吡喃鼠李糖基-(1→4)]-β-D-吡喃葡萄糖苷(4號峰)，偏諾皂苷元-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖苷(5號峰)、重樓皂苷Ⅱ(6號峰)、重樓皂苷Ⅳ(7號峰)、薯蕷皂苷元-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→4)-[α-L-吡喃鼠李糖基-(1→4)]-β-D-吡喃葡萄糖苷(8號峰)。

圖3 供試品溶液(S1)HPLC圖

注：A.混合對照品；B～D.cldo1～cldo3；1.重樓皂苷Ⅶ；2.重樓皂苷PA；3.重樓皂苷H；4.重樓皂苷Ⅵ；5.重樓皂苷Ⅱ；6.重樓皂苷Ⅳ；7.重樓皂苷Ⅲ；8.重樓皂苷Ⅰ；9.重樓皂苷Ⅴ。圖4 9個重樓皂苷混合對照品及cld01、cld02、cld03 HPLC圖

3 討論

本實驗對不同流動相體系(甲醇-水、乙腈-水和乙腈-0.1%磷酸水溶液體系)進行了考察，結果表明，乙腈-水體系分離效果最好，分析時采用梯度洗脫并對不同的梯度程序進行考察。實驗還考察了29、30、31 ℃ 3個不同柱溫，結果表明，柱溫為31 ℃時，分離效果最佳。最后分析條件確定為2.2項下色譜條件，峰分離度較好，保留時間適中。

在筆者前期對滇重樓地上部分總皂苷提取、純化工藝研究的基礎上，本實驗首次建立了滇重樓地上部分總皂苷的指紋圖譜，為滇重樓地上部分總皂苷的質量控制、制備和利用提供參考。