不同光強處理下擬巫山淫羊藿生物學性狀和淫羊藿苷類黃酮的變化△

潘俊倩，李小明，楊倩茹，落艷嬌，4，申國安，徐超群，魏升華，郭寶林*

1.中國醫學科學院 北京協和醫學院 藥用植物研究所，北京 100193；2.軍事醫學研究院 輻射醫學研究所，北京 100850；3.貴州中醫藥大學 藥學院，貴州 貴陽 550025；4.山西醫科大學，山西 太原 030001

淫羊藿為傳統中藥，具有補腎陽、強筋骨、祛風濕的作用。現代研究表明，淫羊藿含有黃酮類、生物堿、多糖、木脂素等多種化學成分[1]。其中，C8位具有異戊烯基的淫羊藿苷類黃酮具有促進雄性功能、雌激素樣作用，抗肝癌、乳腺癌、白血病等和改善心血管系統、骨骼系統等作用；多糖能調節免疫、抗病毒等[2-3]。近年來，隨著市場需求不斷增加，野生淫羊藿資源不斷減少，進行人工栽培是實現資源可持續利用的必由之路。擬巫山淫羊藿EpimediumpseudowushanenseB.L.Guo是2007年發表的淫羊藿屬新物種[4]，分布于貴州貴陽、黔南和黔東南地區及廣西東北部地區等。該物種中朝藿定C含量遠遠高于藥用種類巫山淫羊藿，是淫羊藿屬首個實現了人工栽培的物種。

野生擬巫山淫羊藿主要生長于灌叢下、林緣等環境中，是一種典型的陰生植物，對光的反應非常敏感。種植過程中，一般用70%～90%的遮蔭網，或者種植在相似遮蔭度的林下。本課題組Pan等[5]研究了不同光強處理60 d后擬巫山淫羊藿中淫羊藿苷類黃酮成分差異，發現(18.2±2.5) μmol·m-2·s-1下，擬巫山淫羊藿的生長發育狀態較好，而(54.6±2.5) μmol·m-2·s-1下淫羊藿苷類黃酮積累較多，生物量較大。本研究在以上2種光強下，測定擬巫山淫羊藿植物在萌芽30、60、90、120 d持續生長過程中的各項生長發育指標(株高、復葉面積、分枝數、含水量、葉綠素含量、葉片生物量)以及淫羊藿苷類4種主要黃酮成分(淫羊藿苷、朝藿定C、朝藿定A、朝藿定B)的變化規律，進一步闡明2種光強處理下擬巫山淫羊藿生長發育和黃酮成分積累特點，為淫羊藿的種植和采收提供參考。

1 材料

朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷對照品(實驗室自制，HPLC純度>98%)；乙腈(色譜純，Honeywell International Inc.)；甲醇、乙醇均為分析純，購自北京化工廠；水為娃哈哈純凈水。

LI-3000C型葉面積儀(LI-COR，American Lincoln Industries Co.，Ltd.)；SPAD-502型葉綠素儀(Konica Minolta Inc.)；高效液相色譜儀(Perkin Elmer Instruments Co.，Ltd.)；KQ-250DB型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；AL204-IC型電子分析天平(Mettler Toledo International Trading Co.，Ltd.)；XSl05型電子天平(Mettler Toledo International Trading Co.，Ltd.)。

選取貴州雷山淫羊藿種植基地的1年生健康實生苗，經中國醫學科學院藥用植物研究所郭寶林研究員鑒定為擬巫山淫羊藿EpimediumpseudowushanenseB.L.Guo。

2 方法

2.1 生長指標測定

將淫羊藿實生苗移入中國醫學科學院藥用植物研究所溫室中，花盆基質為泥炭土和蛭石(3∶1)混合。2014年2月1日(新葉萌發前)，選擇長勢一致的植株移入培養間(溫度：20～21 ℃，相對濕度：60%，光照時間：16 h·d-1)，分別在光強(18.2±2.5) μmol·m-2·s-1(L1)和(54.6±2.5) μmol·m-2·s-1(L2)下持續培養一段時間。每個光強下處理36株，在30、60、90、120 d分別取9株測定相關指標。

株高采用卷尺測量莖基到最頂部葉片的高度；復葉面積采用葉面積儀測量一回三出復葉中3片小葉的面積；分枝數為根狀莖上萌發的分枝數；葉片總生物量采用天平測量植物所有新鮮葉片的質量(鮮質量)，然后于60 ℃烘箱中干燥葉片至質量恒定后測量干燥葉片的質量(干質量)；比葉面積(SLA)為復葉面積與復葉干質量的比值；水分含量采用公式(1)計算；葉綠素含量(SPAD值)采用葉綠素儀在650、940 nm波長下測定葉片的葉綠素含量；淫羊藿苷類成分含量采用參考文獻[5]方法，每個植株每個時期取1個小葉片合并為1個樣品，測定葉片中朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C及淫羊藿苷4種淫羊藿苷類黃酮成分含量。

水分含量=1-葉片干質量/葉片鮮質量×100%

(1)

2.2 分析方法

采用SPSS v20軟件對數據進行t檢驗和重復測量的方差分析，用Tukey HSD測試來比較不同方法之間的差異。其中，t檢驗、方差分析和Tukey HSD測試的P值分別設置為0.05。

3 結果與分析

3.1 光強對擬巫山淫羊藿生長發育的影響

3.1.1株高 從圖1看出，2種光強下，30 d均是擬巫山淫羊藿植株的快速增高生長時期。60 d內還有少量生長，和30 d比較差異有統計學意義(P<0.05，下同)；60 d后，L1光強下到90 d略有生長，120 d時不再增高，而L2光強下90 d時已基本沒有生長，2種光強處理90、120 d與60 d差異無統計學意義，表明強光下株高更早達到峰值，停止生長。

注：不同大寫字母表示同一光強下不同處理時間之間的差異性(P<0.05)；不同小寫字母表示同一處理時間下不同光強之間的差異性(P<0.05)；下同。圖1 2種光強持續處理下擬巫山淫羊藿株高的動態變化

3.1.2復葉面積 從圖2看出，2種光強下，擬巫山淫羊藿植株葉片的生長趨勢相同。30 d內葉片大小已經基本達到最大，60、90、120 d與30 d相比差異無統計學意義。

圖2 2種光強持續處理下擬巫山淫羊藿復葉面積的動態變化

3.1.3比葉面積 從圖3看出，2種光強下，30～90 d擬巫山淫羊藿的比葉面積持續減小(且各時期差異均有統計學意義)，其中L1光強下的變化幅度大，90 d后，L1光強下略降低，L2光強下略升高。在30～90 d期間葉面積沒有變化，含水量變化降低幅度較小的情況下，表明有葉片厚度增加或生物量積累的變化。

圖3 2種光強持續處理下擬巫山淫羊藿比葉面積的動態變化

3.1.4分枝數 從圖4看出，2種光強下擬巫山淫羊藿的分枝數增加的節律不同，L1光強下60 d達到最大分枝數，其后已基本沒有增加，90、120 d與60 d差異無統計學意義；而L2光強下分枝數增加到90 d。表明強光有持續促進新分枝形成的作用。

圖4 2種光強持續處理下擬巫山淫羊藿分枝數的動態變化

3.1.5含水量 從圖5看出，2種光強下，擬巫山淫羊藿葉片的含水量在整個處理時期呈現降低趨勢。L1光強下表現出持續降低(各時期差異均有統計學意義)，而L2光強下降低幅度較小，其中在60～90 d差異無統計學意義。表明強光下，葉片的含水量降低達到最終狀態的時間較早。

圖5 2種光強持續處理下擬巫山淫羊藿葉片含水量的動態變化

3.1.6葉綠素含量 從擬巫山淫羊藿的葉片生長來說，30 d完成展葉，但要達到60 d才完全成熟，所以表現出30 d的SPAD較高。從圖6看出，L1光強下，葉片的SPAD在30 d時最高，60 d降低，然后變化不明顯；L2光強下，則30 d和60 d差異無統計學意義，其后持續降低。

圖6 2種光強持續處理下擬巫山淫羊藿葉片葉綠素含量的動態變化

3.1.7單株葉片生物量 從圖7看出，L1光強下，單株葉片生物量(干質量)在緩慢增加，而L2光強下，90 d之前在增加，且增加幅度大于L1光強，90～120 d則略有降低。單株葉片生物量來自植株的單葉片生物量和葉片數量，擬巫山淫羊藿的葉為根狀莖萌發出的基生葉，葉片數量和萌發分枝數直接相關，可看到L1光強下，分枝數在60 d后變化不大，而比葉面積和含水量在降低，因此單株葉片生物量的升高主要來自于干物質積累導致的單葉質量增加，而L2光強下，分枝數在90 d之前增加量較大，而比葉面積和含水量變化較小，因此單株葉片生物量的增加主要來自于分枝數的增加。

圖7 2種光強持續處理下擬巫山淫羊藿葉片生物量的動態變化

3.2 光強對擬巫山淫羊藿苷類黃酮成分含量的影響

2種光強下，朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷4種成分總量參見表1。擬巫山淫羊藿中朝藿定C占4種成分總量的80%以上，而另外3個成分含量較少，因此總成分含量和朝藿定C的含量表現基本一致。

朝藿定A、朝藿定B和淫羊藿苷在L1光強下，大致表現為成分持續降低，可能與干物質積累增加相關；而L2光強下，均表現為先降低，后升高，再降低的趨勢，由于此3個化合物屬于含量較低的成分，影響因素較為復雜，需要進一步研究。

表1 2種光強不同處理時間下擬巫山淫羊藿的4種黃酮成分質量分數及總量 %

4 結論

光強影響植物的多種生長特性，如高度、葉面積、比葉面積、分枝數、總生物量等[6]。擬巫山淫羊藿是陰生藥用植物，前期比較了5種光強對淫羊藿生長發育的影響[5]，發現隨光強增加，分枝數、復葉面積、SPAD值、含水量在(54.6±2.5) μmol·m-2·s-1光強之后差異無統計學意義，而主要成分朝藿定C含量達到最高。其中，(18.2±2.5) μmol·m-2·s-1光強下，復葉面積、SPAD值最大；而(54.6±2.5) μmol·m-2·s-1光強下，含水量最低，朝藿定C及總黃酮含量最高，分枝數達到飽和狀態。

本研究進一步研究2種光強下各個指標的持續變化，發現兩者的變化規律不太一致。2種光強作用下的擬巫山淫羊藿株高均為生長到60 d基本不增加，葉面積的生長期為0～30 d。比葉面積隨發育時間而持續降低，90 d后變化較小。分枝數隨著植物生長，芽從地下根狀莖上萌發而增加。L1光強下，只在30～60 d的時候有所增加，屬于淫羊藿生長發育的一般節律，即早春較短的萌發時間段，但是L2光強下分枝數增加幅度較大，且持續到90 d。經觀察，強光可以刺激的根狀莖上的休眠芽繼續萌發，形成新的地上分枝。有報道，香石竹品種“媚娘”的側芽數在全光照下一直顯著增多，在一層60%透光遮陽網下2008年5月4日前顯著增加，在二層60%透光遮陽網下2008年4月24日之前顯著增加，表現出強光促進側芽數的萌發[7]。葉片的含水量在L1光強下，表現為持續降低，而在L2光強下，60 d基本上達到最終狀態，后續變化很小了。

因此，本研究結果支持課題組的前期研究，L1光強下植物表現為正常的生長發育狀態，而強度為L1的3倍的L2光強，具有刺激擬巫山淫羊藿根狀莖芽萌發作用，也促進葉片的提前成熟；在葉片總產量上，90 d與60 d相比，強光下較弱光下更高。擬巫山淫羊藿的葉綠素含量結果表明，在L2光強下，葉綠素含量持續減少。

淫羊藿苷類成分的含量變化，在不同光照強度下表現不同。弱光下，呈現穩中有升的趨勢；而強光下，則在30 d為最高，隨后均有顯著下降。因此如果選擇較強的光照來獲得較高的擬巫山淫羊藿產量和含量，應在強光處理后及時采收，避免長時間帶來的成分減少。