正交試驗法優選益氣活血顆粒水提工藝△

翁燕，范智毅，劉志輝*

1.南京中醫藥大學 附屬醫院，江蘇 南京 210029；2.南京中醫藥大學，江蘇 南京 210029

益氣活血方來源于江蘇省中醫院，由黃芪、炙黃芪、黨參、麥冬、五味子等中藥組成，具有益氣養陰、涼血散瘀的功效。該方在心內科門診已使用多年，以中醫藥理論為指導組方，不含具有毒性的中藥、無配伍禁忌、無藥味超量，若按傳統工藝制備，申報醫療機構制劑則可以免藥效、毒理和臨床研究資料[1]。本研究采用正交試驗法對益氣活血方進行水提取工藝優選，為其研究、開發及申報醫療機構中藥制劑備案提供理論依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

KQ-1000E型醫用超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器公司)；e2695-2998型高效液相色譜儀(美國Waters公司)；Alltech-ELSD 2000型蒸發光散射檢測器(美國Alltech公司)；WSK-A型自動空氣發生器(天津市津分分析儀器制造有限公司)；AR2140型電子分析天平(美國Ohaus公司)。

1.2 試藥

黃芪甲苷對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：110781-201213)；毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品(南京寧歧醫藥科技有限公司，批號：150326)；乙腈、甲醇(色譜級，Merck公司)；甲酸(色譜級，ROE Scientific Inc)；水為超純水；正丁醇和氨水為分析純。

處方飲片均來自江蘇省中醫院藥學部，由顧和亞主任中藥師鑒定，均符合《中華人民共和國藥典》2015年版。

2 方法與結果

2.1 黃芪甲苷的含量測定

2.1.1色譜條件 Hedera C18ODS-2色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：乙腈-水(32∶68)；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL；漂移管溫度：103 ℃；載氣流量：2.7 L·min-1[2-3]。

2.1.2溶液的制備 對照品溶液制備：精密稱取黃芪甲苷對照品適量于量瓶中，以甲醇定容，得質量濃度為1.051 mg·mL-1的對照品溶液。

供試品溶液制備：量取益氣活血方水提液30 mL，每次加入水飽和正丁醇溶液30 mL萃取，共4次。每次以40 mL氨試液充分洗滌合并得正丁醇液，共洗滌2次后，棄氨試液，取正丁醇液于水浴蒸干，甲醇溶解殘渣，定容于10 mL量瓶中，取續濾液。

陰性樣品溶液制備：取缺黃芪/炙黃芪陰性制劑，按供試品溶液制備方法操作，即得[4-6]。

2.1.3系統適用性試驗 分別吸取2.1.2項下各溶液，注入高效液相色譜儀，按2.1.1項下色譜條件測定，得高效液相色譜-蒸發光散射檢測法(HPLC-ELSD)圖(圖1)。結果表明，益氣活血方供試品與對照品在相同保留時間處均有較大吸收，陰性無干擾。

注：A.對照品；B.供試品；C.陰性樣品；1.黃芪甲苷。圖1 益氣活血方黃芪甲苷色譜圖

2.1.4標準曲線 將黃芪甲苷對照品溶液，加甲醇稀釋至質量濃度分別為1 051.00、840.80、525.50、262.75、131.38、105.10 μg·mL-1，按2.1.1項下色譜條件測定。得回歸方程Y=1.694 1X+4.973 4(r=0.999 5)。結果表明，黃芪甲苷的檢測進樣量線性范圍為1.051～10.51 μg。

2.1.5精密度試驗 將質量濃度為262.75 μg·mL-1的黃芪甲苷對照品，按2.1.1項下條件進樣6次測定，以黃芪甲苷峰面積計，RSD為0.45%，表明儀器精密度良好。

2.1.6穩定性試驗 取同一益氣活血方(批號：1607002)供試品溶液，按2.1.1項下條件，于供試品配制后0、2、4、6、8、12 h進樣，測定，結果以黃芪甲苷峰面積計，RSD為3.54%，表明該方法12 h內穩定性良好。

2.1.7重復性試驗 取同一批益氣活血方樣品(批號：1607002)，共6份，依2.1.2項下方法制備供試品溶液，按2.1.1項下色譜條件測定得黃芪甲苷平均質量分數為0.14 mg·g-1，RSD為4.92%(n=6)，表明該方法重復性良好。

2.1.8加樣回收試驗 取已知指標成分含量的益氣活血方樣品6份，并精密加入黃芪甲苷對照品適量，依2.1.2、2.1.1項下方法制備、測定，結果見表1。

表1 黃芪甲苷加樣回收率試驗結果(n=6)

2.2 毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量測定

2.2.1色譜條件 HederaC18ODS-2色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相A：乙腈，流動相B：0.2%甲酸水溶液，梯度洗脫(0～10 min，10%～20%A；10～20 min，20%～30%A；20～25 min，30%A；25～27 min，30%～10%A；27～30 min，10%A)；檢測波長為260 nm；流速為1.0 mL·min-1；柱溫為30 ℃；進樣量為10 μL[7-8]。

2.2.2溶液的制備 對照品溶液制備：精密稱定毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品適量，加甲醇制成對照品溶液，質量濃度為1.02 mg·mL-1。

供試品溶液制備：精密吸取益氣活血方水提液2 mL，置10 mL量瓶中，加入甲醇適量使溶解并定容，取續濾液，即得。

陰性樣品溶液制備：取缺黃芪/炙黃芪的陰性制劑，依“供試品溶液”方法制備缺黃芪/炙黃芪陰性溶液。

2.2.3系統適用性試驗 取上述對照品溶液、供試品溶液及陰性溶液，按2.2.1項下條件測定，結果見圖2。益氣活血方供試品與對照品在相同位置均有較大吸收，且陰性無雜質干擾。

注：A.對照品；B.供試品；C.陰性樣品；2.毛蕊異黃酮葡萄糖苷。圖2 益氣活血方中毛蕊異黃酮葡萄糖苷色譜圖

2.2.4標準曲線 精密吸取上述對照品溶液，加甲醇稀釋成質量濃度分別為255.000、127.500、25.500、12.750、6.375、3.188、1.594 μg·mL-1的對照品溶液，按2.2.1項下條件測定，得回歸方程Y=23 473X+25 945(r=0.999 9)。毛蕊異黃酮葡萄糖苷在0.016～2.550 μg·mL-1響應值與質量濃度之間線性關系良好。

2.2.5精密度試驗 精密吸取25.5 μg·mL-1的對照品溶液，重復進樣6次，測定峰面積積分值，RSD為0.34%，表明儀器精密度良好。

2.2.6穩定性試驗 取同一批益氣活血方樣品(批號：1607002)，按2.2.2項下方法制備供試品，按2.2.1項下條件，分別于配制后0、2、4、6、8、12 h進樣，測定，結果以峰面積計RSD為0.54%，表明該方法12 h內穩定性良好。

2.2.7重復性試驗 取同一批益氣活血方樣品(批號：1607002)6份，按2.2.2項下方法制備供試品溶液，進樣，測定，結果平均質量分數為0.13 mg·g-1，RSD=1.83%(n=6)，表明該方法穩定性良好。

2.2.8加樣回收率試驗 取已知指標成分含量的益氣活血方樣品，共6份，精密加入毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品適量，按2.2.2項下方法制備供試品溶液，測定，結果見表2。

表2 毛蕊異黃酮葡萄糖苷加樣回收率試驗結果(n=6)

2.3 出膏率的測定

精密吸取益氣活血方水提液樣品適量，置干燥的恒重蒸發皿中，水浴蒸干后，放入烘箱中，設定溫度為105 ℃，干燥3 h，取出后再于干燥器中冷卻20 min，精密稱定并按公式(1)計算。

(1)

2.4 單因素試驗

影響水煎煮的因素有很多，如飲片大小、浸泡與否等，但主要影響因素還是提取次數、提取時間和加水量。

2.4.1提取次數的考察 按益氣活血處方稱取飲片共5份，分別加入10倍量的水，浸泡1 h，按提取次數為1、2、3、4、5次煎煮，每次1 h，濾過，濃縮，再加水定容至適量。按2.1～2.3項下方法制備供試品、測定、計算。結果見圖3。

圖3 益氣活血方提取次數與轉移率、出膏率關系

由圖3可知，煎煮液中黃芪甲苷的轉移率在煎煮3次后增加不明顯，毛蕊異黃酮葡萄糖苷的轉移率在煎煮第1～4次間呈緩慢線性增加，兩者的轉移率在煎煮4次后均稍有降低；出膏率在煎煮2次后增加不明顯。

2.4.2提取時間的考察 按益氣活血處方稱取飲片5份，分別加入10倍量的水，浸泡1 h，按提取時間為0.5、1、1.5、2、2.5 h，分別提取1次，濾過，濃縮，再加水定容至適量。按2.1～2.3項下方法制備供試品、測定、計算。結果見圖4。

圖4 益氣活血方提取時間與轉移率、出膏率關系

由圖4可知，煎煮液中黃芪甲苷的轉移率在煎煮1.5 h后開始下降；毛蕊異黃酮葡萄糖苷的轉移率及出膏率隨時間增加變化不明顯。

2.4.3加水量的考察 按處方稱取飲片5份，按加水量6、8、10、12、14倍分別加水，浸泡1 h，提取1次，每次1 h，濾過，濃縮，再加水定容至適量。按2.1～2.3項下方法分別制備供試品、測定、計算。結果見圖5。

圖5 益氣活血方加水量與轉移率、出膏率關系

由圖5可知，煎煮液中黃芪甲苷的轉移率在加入10倍水的條件下增加明顯，加入12、14倍水轉移率差別不大；毛蕊異黃酮葡萄糖苷的轉移率在加入6、8、10倍水時變化不明顯，加入12倍水時稍有增加。出膏率的增加幅度較小。

2.5 正交試驗

2.5.1正交試驗設計 選擇提取時間(A)、提取次數(B)和加水量(C)為考察因素，平行操作條件下，以黃芪甲苷轉移率、毛蕊異黃酮葡萄糖苷轉移率、出膏率為評價指標，按 L9(34)正交表設計試驗。

2.5.2水煎煮工藝因素水平的選擇 選用正交試驗表L9(34)，見表3。

表3 益氣活血方水煎煮工藝因素水平

2.5.3水煎煮正交試驗結果 黃芪、炙黃芪為方中君藥，所占比例較大，將兩者主要有效成分設為主要指標，出膏率為次要指標。設黃芪甲苷轉移率權重為0.4，毛蕊異黃酮葡萄糖苷轉移率權重為0.4，出膏率權重為0.2，結果見表4～5。

綜合得分=黃芪甲苷轉移率×0.4+
毛蕊異黃酮葡萄糖苷轉移率×0.4+出膏率×0.2

(2)

表4 益氣活血方水煎煮工藝正交試驗設計及直觀分析

表5 益氣活血方水煎煮工藝正交方差分析

由表4可知，B對試驗結果影響較顯著。選擇的3個因素對試驗結果的影響由大到小順序為B>C>A，最佳提取工藝條件為 A2B3C3。由表5可知，B影響差異有統計學意義(P<0.05)，A、C對結果影響差異無統計學意義。綜合考慮生產的各方面因素，確定加12倍量水，提取3次，每次煎煮1 h為最佳提取工藝。

2.5.4水煎煮工藝驗證實驗 按益氣活血處方稱取3份與正交試驗相同批次的飲片，按優選的提取工藝參數進行煎煮，結果見表6。

表6 益氣活血方水煎煮工藝正交驗證實驗 %

所得結果與正交試驗結果最大值基本接近。可判斷，優選的工藝可行、穩定。

2.6 傳統煎煮法

2.6.1傳統煎煮的方法 稱取益氣活血處方中各味飲片，平行5份，煎煮2次，第一煎加水500 mL浸泡1 h，武火煮沸后文火煎煮0.5 h，濾過；第二煎藥渣加水200 mL煎煮0.5 h，合并濾液備用。

2.6.2試驗方法與結果 按2.1～2.3項下方法制備供試品、測定、計算，試驗結果見表7。

表7 益氣活血方傳統煎煮法試驗結果 %

2.6.3傳統煎煮方法與優選工藝結果比較 將傳統煎煮方法與優選工藝結果比較，見圖6。

圖6 益氣活血方傳統煎煮法與優選工藝結果比較

由圖6可知，優選工藝煎煮液的出膏率及有效成分的轉移率均高于傳統煎煮方法，進一步驗證了優選工藝的可靠性。

3 討論

黃芪、炙黃芪為方中君藥，所占比例較大，且補氣升陽作用明顯，與本方專于治療氣虛血瘀型冠心病相一致。故選取黃芪、炙黃芪主要成分作為考察指標。

在建立毛蕊異黃酮葡萄糖苷HPLC時，曾參考《中華人民共和國藥典》2015年版梯度洗脫方法，流動相A為乙腈，流動相B為0.2%甲酸水溶液，梯度洗脫(0～20 min，20%～40%A；20～30 min，40%A)，發現毛蕊異黃酮葡萄糖苷與其他成分的分離并不理想。后改現用的梯度洗脫方法，可以較好地與其他組分分離。

益氣活血方已應用多年，臨床上患者使用的是中藥湯劑，其攜帶、貯存及服用不方便，劑量也不十分準確，因此，需進行劑型改進。以湯劑為基礎的內服制劑可有合劑、顆粒劑等多種口服劑型選擇。合劑保持了湯劑的用藥特點，但其攜帶、貯存不便。顆粒劑不僅具備湯劑相對用藥量大、起效迅速的特點，還具有攜帶、貯存運輸方便、穩定性好、服用量準確等諸多優點，也克服了膠囊劑和片劑載藥量相對有限、服用量達不到治療劑量的缺陷，因此，選擇了顆粒劑作為益氣活血方的劑型。顆粒劑的成型工藝及設備有多種，如濕法制粒、干法制粒、一步制粒法等。一步制粒是目前最常用的工藝方法，便于自動控制，生產環境更加符合《藥品生產質量管理規范》要求，并在很大程度上解決了中藥浸膏黏性大、成型困難等問題。后續按照優選工藝采用一步制粒法進行了3批中試研究，即加12倍量水，煎煮3次，每次1 h。濾液先減壓濃縮(70～75 ℃，-0.04～-0.08 MPa)至相對密度為1.20(60 ℃)左右，趁熱將甜菊素加入，備用。一步制粒前，將稠浸膏加純化水稀釋至相對密度為1.15～1.20(20 ℃)。制粒時，先將糊精吸入流化床中，設置進風溫度為90～100 ℃，待物料溫度達到70～80 ℃時，開始進液。根據實際情況及時調節進樣速度(80～150 r·min-1)、霧化壓力(1.5～2.0 kg·cm-2)、進風量(800～1800 m3·h-1)。進液結束后，70 ℃干燥約1 h。3批中試產品黃芪甲苷轉移率分別為40.49%、40.90%、41.16%，毛蕊異黃酮葡萄糖苷轉移率分別為46.36%、41.82%、41.45%。本實驗優選的提取工藝，為益氣活血顆粒開發為醫療機構制劑提供了參考。

醫療機構中藥制劑多選取醫院臨床應用效果良好的處方研制，療效確切、使用方便、價格低廉，同時也能體現中醫藥特色治療優勢。《中華人民共和國中醫藥法》、2018年國家食品藥品監督管理總局發布關于的“對醫療機構應用傳統工藝配制中藥制劑實施備案管理的公告(2018年第19號)”等相關法規及細則的出臺，將給醫療機構中藥制劑研制與開發帶來更多的激勵、機遇和挑戰[9-11]。