HPLC梯度洗脫法同時測定七制香附丸中7種成分的含量△

江華強，嚴鑄云

1.成都市德康醫院，四川 成都 610091；2.成都中醫藥大學，四川 成都 610075

七制香附丸由醋香附、白芍、酒萸肉、地黃等22味中藥加工而成，現收載于《中華人民共和國藥典》2015年版一部，主要用于氣滯血虛所致的痛經、月經量少、閉經，癥見胸脅脹痛、經行量少、行經小腹脹痛、經前雙乳脹痛、經水數月不行等臨床病癥的治療[1]。方中香附疏肝解郁、行氣散結、調經止痛，為其君藥；白芍養血柔肝、緩急止痛，當歸補血活血、調經止痛，熟地黃、阿膠益精、補血養血，益母草、延胡索、川芎活血祛瘀、行氣止痛，艾葉、艾葉炭溫經散寒止痛，共為臣藥；山茱萸補腎益精，茯苓、白術、人參、稻米健牌益氣、補氣生血，鮮牛乳溫中補虛，砂仁、小茴香溫中行氣，地黃、天冬、食鹽養陰涼血，黃芩清熱燥濕止帶，酸棗仁養血寧心安神，共為佐藥；甘草調和諸藥，為其使藥，諸藥共奏，以達疏肝解郁、養血調經之功效。現代研究表明，七制香附丸對子宮肌瘤[2]、產后便秘[3]、卵巢囊腫氣滯血瘀證[4-5]、輸卵管阻塞性不孕[6]等病癥臨床療效顯著。現行質量標準僅對七制香附丸方中臣藥白芍所含芍藥苷進行定量控制，中藥復方制劑所含成分復雜，各成分之間相互協調、相互制約，單一成分難以全面評價七制香附丸的整體質量，文獻報道中也僅對該制劑所含1～2個成分進行定量測定研究[7-9]。本實驗參考中藥質量標志物確定原則，選取七制香附丸方中君藥醋香附所含主要化學成分香附烯酮、圓柚酮和α-香附酮，臣藥白芍所含活性成分芍藥內酯苷和芍藥苷，佐藥山茱萸所含活性成分莫諾苷和馬錢苷為檢測指標，采用HPLC梯度洗脫法同時測定七制香附丸中7種成分含量，為七制香附丸的質量標準提升和全面評價提供數據支持。

1 儀器與試藥

e2695型高效液相色譜儀(美國Waters公司)；BS110S型電子分析天平(德國Sartorious公司)。

對照品莫諾苷(批號：111998-201703，純度：97.4%)、芍藥苷(批號：110736-201943，純度：95.1%)、馬錢苷(批號：111640-201808，純度：99.0%)、α-香附酮(批號：110748-201815，純度：99.7%)均來源于中國食品藥品檢定研究院；對照品圓柚酮(批號：PRF8072622，純度：97.5%)購于成都普瑞法科技開發有限公司；對照品芍藥內酯苷(批號：18040323，純度：98.5%)、香附烯酮(批號：18051522，純度：95.5%)均來源于上海同田生物技術股份有限公司；乙腈為色譜純；其他試劑為分析純；七制香附丸(批號分別為181117、190102、190305)來源于河南潤弘本草制藥有限公司。

2 方法與結果

2.1 溶液的制備

2.1.1對照品儲備液 精密稱取對照品莫諾苷、馬錢苷、芍藥內酯苷、芍藥苷、香附烯酮、圓柚酮和α-香附酮各適量，用75%甲醇溶液制成含莫諾苷0.298 mg·mL-1、馬錢苷0.152 mg·mL-1、芍藥內酯苷0.334 mg·mL-1、芍藥苷0.718 mg·mL-1、香附烯酮2.476 mg·mL-1、圓柚酮0.542 mg·mL-1、α-香附酮1.318 mg·mL-1的7種對照品儲備儲備液。

2.1.2混合對照品溶液 精密量取上述對照品儲備液各2.5 mL，用75%甲醇制成含莫諾苷14.9 μg·mL-1、馬錢苷7.6 μg·mL-1、芍藥內酯苷16.7 μg·mL-1、芍藥苷35.9 μg·mL-1、香附烯酮123.8 μg·mL-1、圓柚酮27.1 μg·mL-1、α-香附酮65.9 μg·mL-1的混合對照品溶液。

2.1.3七制香附丸供試品溶液和陰性樣品溶液 取七制香附丸細粉約2.0 g，精密稱定，精密加入75%甲醇25 mL，稱定質量，加熱回流提取60 min，擦干外壁，放冷，再稱質量，用75%甲醇溶液補足減失質量，搖勻，濾過，即得七制香附丸供試品溶液。按七制香附丸的處方工藝，分別制備缺山茱萸、缺白芍和缺香附的陰性樣品，再按上述方法制成陰性樣品溶液。

2.2 色譜條件及專屬性試驗

色譜柱：Shim-pack GIST C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；檢測波長：240 nm[10-12]；以乙腈(A)-0.3%磷酸溶液(B)為流動相，梯度洗脫(0～10.0 min，9.0%A；10.0～22.0 min，9.0%～16.0%A；22.0～37.0 min，16.0%～21.0%A；37.0～61.0 min，21.0%～45.0%A；61.0～70.0 min，45.0%～9.0%A)；柱溫：30 ℃；流速：1.0 mL·min-1；進樣量：10 μL。取2.1.2～2.1.3項下溶液各10 μL進樣檢測，結果表明，七制香附丸供試品色譜圖基線平穩，莫諾苷、馬錢苷、芍藥內酯苷、芍藥苷、香附烯酮、圓柚酮和α-香附酮峰形對稱，分離度>1.5，理論塔板數按各成分色譜峰計均大于等于4000，陰性樣品對七制香附丸中莫諾苷、馬錢苷、芍藥內酯苷、芍藥苷、香附烯酮、圓柚酮和α-香附酮7種成分的同時測定無干擾，色譜圖見圖1。

注：A.混合對照品；B.七制香附丸；C.山茱萸陰性樣品；D.白芍陰性樣品；E.香附陰性樣品；1.莫諾苷；2.馬錢苷；3.芍藥內酯苷；4.芍藥苷；5.香附烯酮；6.圓柚酮；7.α-香附酮 。圖1 七制香附丸混合對照品、樣品及陰性樣品HPLC圖

2.3 標準曲線及線性范圍

分別精密吸取2.1.1項下對照品儲備液各0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL，用75%甲醇溶液制成6個含莫諾苷、馬錢苷、芍藥內酯苷、芍藥苷、香附烯酮、圓柚酮和α-香附酮25倍質量濃度梯度的混合對照品溶液，依法進樣檢測，以質量濃度(X)為橫坐標，莫諾苷、馬錢苷、芍藥內酯苷、芍藥苷、香附烯酮、圓柚酮和α-香附酮的峰面積(Y)為縱坐標進行回歸，結果見表1。

表1 七制香附丸中7種成分的線性關系考察結果

2.4 精密度考察

取2.1.2項下混合對照品溶液連續進樣6次，測得莫諾苷、馬錢苷、芍藥內酯苷、芍藥苷、香附烯酮、圓柚酮和α-香附酮峰面積的RSD分別為1.11%、1.26%、0.98%、0.72%、0.53%、0.84%和0.67%。

2.5 重復性考察

取同一批次(批號：181117)七制香附丸樣品適量，平行制備6份七制香附丸供試品溶液，依法進樣測定，記錄莫諾苷、馬錢苷、芍藥內酯苷、芍藥苷、香附烯酮、圓柚酮和α-香附酮的峰面積，計算各成分含量，結果各成分含量的RSD分別為1.63%、0.85%、1.46%、1.17%、0.94%、1.47%和1.21%。

2.6 穩定性考察

取同一批次(批號：181117)七制香附丸樣品適量，臨用新配1份七制香附丸供試品溶液，分別于0、2、4、8、10、12 h分別進樣檢測，記錄莫諾苷、馬錢苷、芍藥內酯苷、芍藥苷、香附烯酮、圓柚酮和α-香附酮的峰面積，結果七制香附丸供試品溶液12 h內穩定，各成分峰面積的RSD分別為1.09%、1.24%、0.95%、0.70%、0.56%、0.82%和0.65%。

2.7 回收率試驗

取同一批次(批號：181117)已知成分含量的七制香附丸細粉9份，每份1.0 g，精密稱定，分別精密加入混合對照品溶液(莫諾苷、馬錢苷、芍藥內酯苷、芍藥苷、香附烯酮、圓柚酮和α-香附酮質量濃度分別為0.087、0.043、0.125、0.259、0.896、0.155、0.447 mg·mL-1)1.0 mL 3份、2.0 mL 3份、3.0 mL 3份，使莫諾苷、馬錢苷、芍藥內酯苷、芍藥苷、香附烯酮、圓柚酮和α-香附酮對照品加入量約為樣品原有量的50%、100%和150%，再按上述方法制成加樣供試品溶液，依法進樣測定莫諾苷、馬錢苷、芍藥內酯苷、芍藥苷、香附烯酮、圓柚酮和α-香附酮的峰面積，計算各成分的加樣回收率及RSD，結果見表2。

2.8 七制香附丸中7種化學成分含量測定

取3批七制香附丸樣品適量，按2.1.3項下方法每個批次平行制備3份供試品溶液，依法進樣測定莫諾苷、馬錢苷、芍藥內酯苷、芍藥苷、香附烯酮、圓柚酮和α-香附酮的峰面積，計算七制香附丸中7種化學成分的含量，結果見表3。

表2 七制香附丸中7種成分的加樣回收率試驗結果(n=9)

續表2

表3 七制香附丸中7種成分的含量(n=3) mg·g-1

3 討論

3.1 流動相的選擇

根據七制香附丸中待測化學成分莫諾苷、馬錢苷、芍藥內酯苷、芍藥苷、香附烯酮、圓柚酮和α-香附酮的不同性質，為達到最佳的分離效果，參考相關文獻，對不同流動相體系(甲醇-水[13-14]、乙腈-水[15])進行對比考察，結果乙腈-水流動相體系各成分分離效果較佳，但芍藥內酯苷、莫諾苷色譜峰存在拖尾；遂在HPLC流動相的水相中加入一定量的酸(0.1%甲酸[16]、0.1%冰乙酸、0.1%磷酸[17]、0.3%磷酸[18])進行對比考察，并對流動相比例不斷優化，最終確定按照正文中流動相及梯度洗脫程序對七制香附丸中莫諾苷、馬錢苷、芍藥內酯苷、芍藥苷、香附烯酮、圓柚酮和α-香附酮7種成分進行同時測定，此流動相體系下，所檢測色譜圖基線平穩，待測化學成分莫諾苷、馬錢苷、芍藥內酯苷、芍藥苷、香附烯酮、圓柚酮和α-香附酮分離較好，峰形對稱，靈敏度高。

3.2 供試品提取方式的優化

在制備供試品溶液時，首先對提取溶劑進行考察，以七制香附丸中待測化學成分莫諾苷、馬錢苷、芍藥內酯苷、芍藥苷、香附烯酮、圓柚酮和α-香附酮的綜合提取率及色譜圖雜質數量等為指標，參考相關文獻對比了提取溶劑(甲醇[12-15]、75%甲醇[16]、50%甲醇[17]、95%乙醇、75%乙醇[10-11])對考察指標的影響，結果以75%甲醇為提取溶劑時，莫諾苷、馬錢苷、芍藥內酯苷、芍藥苷、香附烯酮、圓柚酮和α-香附酮的綜合提取率最佳；遂又分別對提取方式(超聲提取法[12-14，16-18]、加熱回流法[11])進行考察，結果顯示，加熱回流提取各化學成分綜合提取率明顯高于超聲提取結果，可能與七制香附丸中7種待測目標成分莫諾苷、馬錢苷、芍藥內酯苷、芍藥苷、香附烯酮、圓柚酮和α-香附酮來源藥材醋香附、白芍、山茱萸直接細粉入藥的生產工藝有關，同時對提取時間不斷摸索，最終選擇75%甲醇溶液加熱回流提取60 min對七制香附丸供試品進行制備。

本研究首次采用HPLC梯度洗脫法對七制香附丸中莫諾苷、馬錢苷、芍藥內酯苷、芍藥苷、香附烯酮、圓柚酮和α-香附酮含量進行同時測定，所建立的方法操作便捷、結果準確、重復性好，為更全面地評價七制香附丸的產品質量，不斷提升七制香附丸的質量控制標準提供參考。