風味蛋白酶水解鰻魚工藝的優化

伍菱 ，張其標，楊遠帆 ，姜澤東

1. 集美大學食品與生物工程學院（廈門 361021）；2. 福建省食品微生物與酶工程重點實驗室（廈門 361021）

鰻魚學名鰻鱺，是我國重要的經濟魚類，含有豐富的蛋白質、脂類和維生素等，是集營養價值和醫療保健于一身的水產品[1]，素有“水中人參”的美譽。我國是世界上最大的鰻魚養殖、加工和出口國家，鰻魚產品已成為我國單項農產品出口創匯最多的商品。但是，目前國內鰻魚加工企業多數以烤鰻為主，產品形式單一，使得鰻魚產業受國外市場（尤其是日本市場）的影響非常大。一旦國外市場受到貿易壁壘及其他政治問題而縮減，鰻魚的銷量、養殖及加工效益就急劇降低[2]。近年來，受到中美貿易戰影響，從2018年9月份開始鰻魚及制品出口受阻，導致鰻魚收購價格維持在12萬元/t左右，大規格鰻魚價格不斷下降，超大規格收購價格跌破7萬元/t，至2019年1月份跌至6.4萬元/t，還有持續下跌趨勢[3]。因此，研發新產品和新工藝，開發出能擴大出口和內銷的適宜產品形式是拓寬國內外兩個消費市場、保障鰻魚產業健康發展的必要途徑。

現代研究發現，很多天然蛋白質經水解后，不但消化吸收性、溶解性、黏度、乳化性等關鍵參數能夠得到很大程度的改善，而且還表現出一系列獨特的生理活性[4-6]。蛋白水解物的制備方法主要有化學法和酶法。化學法雖然簡單價廉，但由于反應條件劇烈，生產過程中氨基酸受損嚴重，使L-氨基酸形成D-氨基酸，并可能形成有毒物質（如氯丙醇等），且難以根據所需的水解程度對水解過程進行控制[7]。與傳統的化學法相比，酶法水解條件溫和，氨基酸不被破壞，構型不發生變化，在營養成分的保留上有著不可比擬的優點，同時隨著固定化技術和膜發生器的發展，蛋白酶的成本不斷降低，酶技術的研究和應用更加深入，酶解過程更趨于自動化、簡單化，因此酶法水解成為有效利用蛋白質資源的主要方法。

風味蛋白酶由米曲霉發酵產生，同時具備內切酶和外切酶的活性，是一種被廣泛運用的商業酶[8-9]。此次試驗選用風味蛋白酶對鰻魚進行水解，對影響酶解效果的溫度、時間、pH、酶添加量及底物蛋白質濃度進行研究，優化確定風味蛋白酶水解鰻魚的適宜條件，為利用酶技術生產高附加值的鰻魚產品提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗原料

歐洲鰻魚（鰻鱺），購于集美大學水產學院養殖廠。

1.1.2 主要試劑

風味蛋白酶（6萬 U/g），購于諾維信（中國）投資有限公司；干酪素，購于中國醫藥集團上海化學試劑公司；氫氧化鈉、鹽酸、甲醛、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、三氯乙酸、碳酸鈉、硼酸、濃硫酸，均為分析純，購于西隴化工股份有限公司。

1.1.3 主要儀器與設備

FiveEasy20型臺式酸度測定儀，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；HH-4（雙列）型數顯恒溫水浴鍋，常州國華電器有限公司；KDC-1044型低速大容量多管離心機，科大創新股份有限公司中佳分公司；FA1004N分析天平，上海精科有限公司；WCJ-802磁力攪拌機，常州國華電器有限公司；722PC型可見分光光度計，上海欣茂儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 原料處理

將新鮮鰻魚宰殺、清洗、瀝干、絞碎，為保證絞碎程度及原料的均勻一致性，進行二次絞碎處理。絞碎后分裝，置于-18 ℃條件下貯藏，備用。

1.2.2 樣品制備

冷凍原料→解凍→加水混勻→調pH→加酶水解→滅酶→冷卻→離心（3 500 r/min，15 min）→上清液

1.2.3 酶解工藝條件的優化

以水解度為指標，先采用單因素試驗方法研究鰻魚水解所需的適宜溫度和pH，再通過中心組合試驗及響應面分析方法確定最適底物濃度和加酶量，在此基礎上進一步優化水解時間。

1.2.4 測定方法

氨基態氮含量，甲醛電位滴定法；總氮含量，半微量凱氏定氮法測定；非蛋白氮含量，樣品加入一定體積10%的三氯乙酸充分研磨，再用10%的三氯乙酸定容，過濾取濾液，用半微量凱氏定氮法測定含氮量[10]。

1.2.5 計算方法[11]

1.2.6 數據處理與分析

響應面試驗結果用SAS軟件進行處理分析[12]，所有試驗平行3次，結果取其平均值。

2 結果與分析

2.1 溫度對鰻魚水解效果的影響

固定底物蛋白質濃度2.48%，調節體系pH 7.0，以1.2萬 U/g比例加入風味蛋白酶，分別置于40，45，50，55和60 ℃條件下進行水解。1 h后，測定水解液中的氨基態氮含量，計算水解度，結果如圖1所示。

圖1 溫度對風味蛋白酶水解鰻魚效果的影響

在試驗范圍內，水解度隨著溫度的升高呈現先上升后下降的趨勢，當溫度為50 ℃時，水解度達到最高。其原因是：反應初始階段，酶促反應的速率隨著溫度的升高而增大，故水解得到的氨基態氮含量增多；但是當溫度升高時，除了酶促反應的速率隨之提高外，酶蛋白變性導致酶活力喪失的速率也加快，酶促反應受到抑制，水解度下降[12]。因此，在用風味蛋白酶對鰻魚進行水解時，溫度控制在50 ℃左右較為適宜。

2.2 pH對鰻魚水解效果的影響

固定底物蛋白質濃度2.48%，以1.2萬 U/g比例加入風味蛋白酶，將體系的pH分別調整為6.0，6.5，7.0，7.5和8.0，置于50 ℃溫度條件下進行水解。1 h后，測定水解液中的氨基態氮含量，計算水解度，結果如圖2所示。在pH 6.0～8.0范圍內，水解度隨著pH的增加先升高后下降。pH 7.0時，水解效果最好，水解度最高；pH高于或者低于7.0，水解度均有一定程度的下降。其主要原因是：pH過高或者過低均會因酶空間構象的改變而使酶失活；另外，pH可以改變底物的解離狀態，影響它與酶的結合[13]，因此其水解度相應變小。因此，在用風味蛋白酶對鰻魚進行水解時，將體系的pH調整為7.0所獲得的酶解效果較好。

圖2 pH對風味蛋白酶水解鰻魚效果的影響

2.3 最適底物蛋白質濃度和加酶量的確定

根據前期預試驗確定的水平范圍（表1），采用中心組合試驗優化風味蛋白酶水解鰻魚的最適底物蛋白質濃度和最適加酶量，試驗設計與結果如表2所示。以酶解反應的水解度為響應值，對結果進行方差分析和回歸分析，結果分別見表3和表4。

表1 風味蛋白酶水解鰻魚中心組合試驗的因素水平表

表2 風味蛋白酶水解鰻魚中心組合試驗的設計及結果

表3 風味蛋白酶水解鰻魚中心組合試驗結果的方差分析表

表4 風味蛋白酶水解鰻魚中心組合試驗結果的回歸分析表

由表3可知，總模型、線性模型和二次方模型差異顯著，而交互作用不顯著；模型的R2值為0.96，表明模型可以較好地擬合試驗數據。由表4可知，X1、X2、X12、X22的顯著水平分別為0.001 4，0.000 2，0.011 7和0.026 3，是影響水解效果的主要因素，而X1X2的顯著水平為0.468 4，大于5%，說明這個因素對結果沒有顯著影響。由表4可進一步確定風味蛋白酶添加量及底物蛋白質濃度對鰻魚水解效果影響的模型，如式（2）所示。

結合表4的顯著值，可以獲得簡化的模型，如式（3）所示。

由響應面可以預測，風味蛋白酶水解鰻魚的最優條件為X1=0.383 0，X2=1.168 8，即加酶量為9 532 U/g，底物濃度為19.36%。

2.4 水解時間對鰻魚水解程度的影響

在通過上述試驗確定的最優酶解條件下（底物蛋白質濃度19.36%，加酶量9 532 U/g，溫度50 ℃，pH 7.0），利用風味蛋白酶對鰻魚進行水解，分別于2，4，6，8和10 h時取樣，測定水解液氨基態氮含量，計算水解度，研究處理時間對水解效果的影響，結果如圖3所示。水解度是衡量蛋白質酶解程度的重要特征指標，與酶解產物的成分和功能特性有直接關系。近年來，很多學者針對不同程度的蛋白質酶解產物，除了分析其肽段分子量、氨基酸組成以外，還對它們的功能特性及其作為添加劑對食品品質的影響進行了研究。李媛媛等[14]研究了堿性蛋白酶水解玉米蛋白產物的抗氧化能力及乳化能力與水解度的關系，發現隨著水解時間的延長，酶解產物的抗氧化能力逐漸增強，而乳化活性、乳化穩定性和ζ電勢等則呈現先增加后降低的變化趨勢。胡莉麗等[15]在研究水解度對麥胚清蛋白酶解物功能特性和抗氧化力的影響時發現，隨著水解度的增加，酶解產物的溶解性大幅提高，乳化性和乳化穩定性剛好相反，而清除自由基能力則是先升高后降低。楊昭等[16]利用胰蛋白酶限制性酶解牡蠣肉，通過感官指標、肽段分量分布和游離氨基酸組成，多角度分析了水解度對牡蠣酶解產物的影響，并比較了加入不同水解度的牡蠣酶解液以后，餅干在感官、色度和風味等方面的差異。Noman等[17]利用堿性蛋白酶水解中華鱘蛋白質，結果表明水解物中粗蛋白含量、氨基酸總量、溶解性和抗氧化活性隨著水解度的增大而升高。因此，為了更好地發揮蛋白質酶解產物的營養價值和功能特性，在食品研發及加工過程中，應該有控制地進行水解，精準制備出符合產品特點的酶解產物。

圖3 時間對風味蛋白酶水解鰻魚效果的影響

因風味蛋白酶含有內切酶和肽酶，增加了底物的水解位點，能使酶解更徹底。前期試驗結果也表明，相比于中性蛋白酶、堿性蛋白酶、酸性蛋白酶以及復合蛋白酶，風味蛋白酶對鰻魚具有更高的水解度和總氮回收率。由圖3可以看出，隨著水解時間的延長，水解液中的氨基態氮含量、水解度不斷增加，而且提升跨度很大，由2 h的24.21%增加到10 h的40.55%，為開發不同氨基酸組成、不同活性功效的鰻魚產品提供更多可能性。

3 結論

試驗以水解度為指標，通過單因素試驗和中心組合試驗對風味蛋白酶水解鰻魚的溫度、pH、底物蛋白質濃度、加酶量進行了優化，研究了反應時間對水解度的影響。結果表明，在溫度50 ℃、pH 7.0的條件下，風味蛋白酶水解鰻魚的適宜加酶量為9 532 U/g，底物蛋白質濃度為19.36%；在試驗范圍內，水解度隨反應時間的延長而不斷升高，10 h時達到40.55%。后續可結合感官評分、氨基酸組成及相關活性分析，進一步研究不同水解度的酶解產物性質，為有針對性地開發高值化鰻魚產品提供更多的數據支撐。