魚頭中活性成分提取工藝優(yōu)化及定性分析

王振強(qiáng)，賈俊偉，申森，王昊

1. 黃河水利職業(yè)技術(shù)學(xué)院（開封 475004）；2. 天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院（天津 300457）

鯽魚屬于鯉科動物，在我國主要產(chǎn)于各地的江河湖泊。鯽魚肉質(zhì)細(xì)嫩鮮美，營養(yǎng)豐富，食之鮮而不膩，營養(yǎng)價值較高[1]。鯽魚頭中含有豐富的活性物質(zhì)，其中磷脂和脂肪酸的含量較高，它們具有很多重要的生理活性功能，是不可多得的營養(yǎng)物質(zhì)[1]。磷脂（phosopholipids），是一類含有磷酸的脂類，也稱磷脂類，屬于復(fù)合脂[2]。磷脂是生物膜的重要組成物質(zhì)，具有增強(qiáng)腦力、安定神經(jīng)、提高免疫力、解毒利尿、清潔血液、健美肌膚、延緩衰老等功效，在食品、醫(yī)藥、化工、環(huán)保及化妝品等領(lǐng)域中有著重要的用途[2]。目前，磷脂類產(chǎn)品被譽(yù)為21世紀(jì)的營養(yǎng)保健食品，風(fēng)行于美國、日本及歐洲及發(fā)達(dá)國家。脂肪酸（fatty acid），是最簡單的一種脂，它是一端含有一個羧基的長的脂肪族碳?xì)滏溣袡C(jī)物[3]。鯽魚頭中的脂肪酸絕大部分為不飽和脂肪酸，飽和脂肪酸含量很低，而不飽和脂肪酸中的ω-3系列對腦的營養(yǎng)極為重要。脂肪酸是生物機(jī)體主要能量的來源物質(zhì)，它具有降血脂、防治冠心病等作用，能夠促進(jìn)兒童生長發(fā)育、智力發(fā)育和記憶力等生理功能[3]，被廣泛用于洗滌劑、化妝品、橡膠、涂料、肥皂、工業(yè)脂肪酸鹽、油漆等行業(yè)[3]。

該研究以鯽魚頭為原料，采用乙醇、氫氧化鈉溶液提取魚頭中的磷脂及脂肪酸等活性成分，與有機(jī)溶劑法提取相比具有工藝簡單易操作、提取成本較低、試劑對人體無毒無害等優(yōu)點(diǎn)。開發(fā)磷脂及不飽和脂肪酸產(chǎn)品具有較好的市場應(yīng)用前景。該研究為魚類產(chǎn)品加工的下腳料魚頭的綜合利用提供理論依據(jù)，具有重要的研究價值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鯽魚頭（市售）；乙醇、氫氧化鈉、乙醚、甲醇、鹽酸、丙酮、氫氧化鉀、氯仿等試劑（均為分析純，天津化學(xué)試劑三廠）；考馬斯亮藍(lán)G-250染料（分析純，上海化學(xué)試劑有限公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

KH-3000PLUS薄層色譜儀（上海科曉科學(xué)儀器有限公司）；GC7890Ⅱ氣相色譜分析儀（上海天美科學(xué)儀器有限公司）；SP-2102UV型紫外分光光度計(jì)（上海光譜儀器有限公司）[4]；電動攪拌器（天津河?xùn)|利華儀器廠）；LD4-40型離心機(jī)（北京醫(yī)用離心機(jī)廠）；YP10002電子天平（上海光正醫(yī)療儀器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 鯽魚頭處理

將鯽魚頭剁碎，準(zhǔn)確稱其質(zhì)量，倒入配制好的乙醇、氫氧化鈉溶液中，充分溶解。

1.3.2 提取率測定[5]

式中：C為活性成分提取物的質(zhì)量，g；M為鯽魚頭的質(zhì)量，g。

1.3.3 提取單因素試驗(yàn)

1.3.3.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對提取的影響

鯽魚頭料液比1∶4（g/mL），Na+濃度1%，乙醇體積分?jǐn)?shù)分別為70%，75%，80%，85%和90%，室溫下提取，攪拌時間15 h，測定提取率，分析乙醇體積分?jǐn)?shù)對提取效果的影響[5]。

1.3.3.2 Na+濃度對提取的影響

鯽魚頭料液比1∶4（g/mL），Na+濃度分別為0%，1%，2%，3%，4%和5%，乙醇體積分?jǐn)?shù)80%，室溫下提取，攪拌時間15 h，測定提取率，分析Na+濃度對提取效果的影響[6]。

1.3.3.3 攪拌時間對提取的影響

鯽魚頭料液比1∶4（g/mL），Na+濃度1%，乙醇體積分?jǐn)?shù)80%，室溫下提取，攪拌時間分別為5，10，15，20和25 h，測定提取率，分析攪拌時間對提取效果的影響。

1.3.3.4 料液比對提取的影響

鯽魚頭料液比分別為1∶3，1∶4，1∶5，1∶6和1∶7（g/mL），Na+濃度1%，乙醇體積分?jǐn)?shù)80%，室溫下提取，攪拌時間15 h，測定提取率，分析料液比對提取效果的影響[7]。

1.3.4 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

表1 正交試驗(yàn)因素水平

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取攪拌時間、乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比3個因素，以提取率為考核指標(biāo)，按表1進(jìn)行正交試驗(yàn)。

1.3.5 提取物成分測定

1.3.5.1 水分含量的測定

采用烘箱法（又稱標(biāo)準(zhǔn)法）測定提取物中水分含量[8]。

式中：A位提取物試樣中水分質(zhì)量，g；W為提取物試樣的質(zhì)量，g。

1.3.5.2 脂肪酸含量的測定

采用滴定法測定提取物中脂肪酸的含量。精確稱取5.0 g提取物樣品，置于錐形瓶中，水浴微熱熔觸，加入50 mL乙醚-乙醇混合液，充分溶解，加入5滴1%酚酞，用KOH標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至粉紅色10 s內(nèi)不褪色，記錄消耗KOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積數(shù)，以油酸計(jì)脂肪酸含量[9]。

式中：V為消耗KOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積數(shù)，mL；C為KOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，mol/L；282為油酸的相對分子質(zhì)量；W為提取物樣品的質(zhì)量，g。

1.3.5.3 丙酮不溶物含量的測定

采用丙酮溶解法測定提取物中丙酮不溶物的含量。

式中：B為丙酮不溶物的質(zhì)量，g；W為提取物試樣的質(zhì)量，g。

1.3.5.4 蛋白質(zhì)含量的測定

采用考馬斯亮藍(lán)法測定提取物中蛋白質(zhì)的含量。取9支試管，3支試管添加0.02，0.04和0.08 mg提取物，用蒸餾水補(bǔ)充到0.1 mL。其余試管標(biāo)好編號，分別加入0，0.02，0.04，0.06，0.08和0.1 mL 1.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液，分別加入5.0 mL考馬斯亮藍(lán)G-250染料，靜置5 min，測試樣在595 nm處的吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品的蛋白質(zhì)含量[10]。

1.3.5.5 多糖含量的測定

采用苯酚-硫酸法測定提取物中多糖的含量。準(zhǔn)確稱取20 mg標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖，置于500 mL容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，分別吸取0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4，1.6和1.8 mL，用蒸餾水補(bǔ)至2.0 mL，加1.0 mL 6%苯酚和5.0 mL濃H2SO4，搖勻，室溫放置20min，以蒸餾水作空白液，測定490 nm處的吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算多糖的含量[11]。

1.3.5.6 磷脂含量的測定

采用紫外分光光度法測定提取物中磷脂的含量[12]。準(zhǔn)確稱取20 mg磷脂酰膽堿標(biāo)準(zhǔn)品，置于100 mL容量瓶中，加正己烷溶解，定容至刻度，搖勻。分別吸取0，0.2，0.4，0.6，0.8和1.0 mL，用正己烷補(bǔ)至1.0 mL，加0.2 mL碘-正己烷溶液，靜置10 min，用正己烷定容至刻度，測定292 nm處的吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品中磷脂的含量。

1.3.6 磷脂的定性分析

采用薄層色譜法（Thin Layer Chromatography，簡稱TLC）對提取物中的磷脂進(jìn)行定性分析[13]。用上行法將提取物在硅膠板上展層，噴磷脂顯色劑。展開劑是V（正己烷）∶V（乙醚）∶V（冰醋酸）=80∶30∶1。

1.3.7 脂肪酸的定性分析

采用氣相色譜法（gas chromatography，簡稱GC）對提取物中的游離脂肪酸進(jìn)行定性分析[13]。氣相條件：SE-54毛細(xì)管柱（15 m×0.25 mm×0.25 mm）；FID檢測器；色譜柱溫度，200 ℃、進(jìn)樣口溫度，280℃、檢測器溫度，280 ℃；氮?dú)猓? mL/min；氫氣，30 mL/min；空氣，400 mL/min；尾吹氣，30 mL/min；進(jìn)樣量，1 μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取單因素試驗(yàn)

2.1.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)的選擇

由圖1可以看出，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的加大，活性成分的提取率逐漸增大，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到75%時，提取率增大的速度緩慢；當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到85%時，提取率開始減小。這是因?yàn)榉磻?yīng)開始時，反應(yīng)溶液中的提取物濃度比較大，乙醇與提取物接觸比較充分，反應(yīng)速度逐漸加快，提取率逐漸增大，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，提取物的濃度逐漸減小，提取率增大的速度逐漸緩慢，當(dāng)反應(yīng)進(jìn)行到一定程度后，提取物消耗比較大，濃度很低，即使乙醇體積分?jǐn)?shù)在逐漸增大，提取率也會開始減小。考慮到乙醇的價格問題，選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)75%比較合適。

圖1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對提取率的影響

2.1.2 Na+濃度的選擇

由圖2可以看出，隨著Na+濃度的增加，活性成分提取率逐漸增大，當(dāng)Na+濃度達(dá)到1%時，提取率開始減小；當(dāng)Na+濃度達(dá)到3%時，提取率趨于穩(wěn)定狀態(tài)。這是因?yàn)榉磻?yīng)開始時，溶液中提取物的濃度比較大，Na+與提取物接觸比較充分，反應(yīng)速度增大，提取率逐漸增加，當(dāng)反應(yīng)進(jìn)行到一定程度后，提取物逐漸消耗，濃度減小，即使再增大Na+濃度，提取率也會逐漸降低。綜合分析，選擇Na+濃度1%比較合適。

圖2 Na+濃度對提取率的影響

2.1.3 攪拌時間的選擇

由圖3可以看出，隨著攪拌時間的增加，活性成分提取率逐漸增大，當(dāng)攪拌時間增大到15 h時，提取率開始下降。這是因?yàn)榉磻?yīng)開始時，溶液中提取物、乙醇和Na+濃度都比較大，接觸比較充分，反應(yīng)速度加快，提取率逐漸增大，當(dāng)攪拌反應(yīng)時間到達(dá)一定程度后，反應(yīng)體系中各物質(zhì)消耗很大，反應(yīng)速度開始降低，提取率逐漸減小。綜合分析，選擇攪拌時間15 h比較合適。

圖3 攪拌時間對提取率的影響

2.1.4 料液比的選擇

由圖4可以看出，隨著料液比的提高，活性成分提取率逐漸增大，當(dāng)料液比為1∶4（g/mL）時，提取率開始逐漸減小。這是因?yàn)榉磻?yīng)開始時，溶液中反應(yīng)物質(zhì)濃度都比較大，接觸比較充分，反應(yīng)速度加快，提取率逐漸增大，當(dāng)反應(yīng)進(jìn)行到一定程度后，反應(yīng)物質(zhì)由于消耗濃度減小，反應(yīng)速度降低，提取率逐漸減小。考慮到料液比越大，提取液濃度越小，越不利于活性成分的提取。綜合分析，選擇料液比1∶4（g/mL）比較合適。

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，選取攪拌時間、乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比3個因素，以提取率為考察指標(biāo)，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，優(yōu)化提取工藝，正交試驗(yàn)結(jié)果見表2。

圖4 料液比對提取率的影響

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

由表2可以看出，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過正交試驗(yàn)優(yōu)化的活性成分提取工藝中攪拌時間、乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比等因素的最佳條件為A3B1C1，即攪拌時間15 h，乙醇體積分?jǐn)?shù)75%，料液比1∶4（g/mL）。攪拌時間、乙醇體積分?jǐn)?shù)和料液比對活性成分提取率的影響因素大小為C＞B＞A，即料液比＞乙醇體積分?jǐn)?shù)＞攪拌時間。

綜上所述，根據(jù)單因素試驗(yàn)及正交試驗(yàn)結(jié)果，鯽魚頭中活性成分的最佳提取工藝條件是攪拌時間15 h、乙醇體積分?jǐn)?shù)75%、料液比1∶4（g/mL）、Na+濃度1%。在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，活性成分提取率為13.57%。

2.3 提取物中活性成分的測定

2.3.1 水分含量的測定

利用烘箱法（又稱標(biāo)準(zhǔn)法）測定提取物中水分的含量，結(jié)果如表3所示。由表3可知，提取物中水分的含量取3次平行試驗(yàn)結(jié)果的平均值為51.68%。

表3 水分含量

2.3.2 脂肪酸含量的測定

采用滴定法測定提取物中游離脂肪酸的含量消耗的KOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積數(shù)是47.3 mL，由方法1.3.4.2中脂肪酸含量測定公式計(jì)算得出提取物中脂肪酸的含量是26.68%。

2.3.3 丙酮不溶物含量的測定

采用丙酮溶解法測定提取物中丙酮不溶物的含量，結(jié)果如表4所示。

由表4可知，提取物中丙酮不溶物的含量取3次平行試驗(yàn)結(jié)果的平均值為15.93%。

表4 丙酮不溶物含量

2.3.4 蛋白質(zhì)含量的測定

采用考馬斯亮藍(lán)法測定提取物中蛋白質(zhì)的含量，其標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖5所示。

由圖5可知，測定蛋白質(zhì)含量標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為y=0.008 1x+0.003 4，R2=0.998 5。根據(jù)測定3個提取物樣品的吸光度，計(jì)算得出的提取物中蛋白質(zhì)的含量分別是0.97%，1.02%和0.93%，取3個平行試驗(yàn)樣品的平均值，得出提取物中蛋白質(zhì)的含量是0.973%。

圖5 測定蛋白質(zhì)含量標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3.5 多糖含量的測定

采用苯酚-硫酸法測定提取物中多糖的含量，其標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖6所示。

由圖6可知，測定多糖的含量標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為y=0.016 9x-0.025 5，R2=0.995 7。根據(jù)測定3個提取物樣品的吸光度，計(jì)算得出的提取物中多糖的含量分別是0.42%，0.47%和0.44%，取3個平行試驗(yàn)樣品結(jié)果的平均值，得出提取物中蛋白質(zhì)的含量是0.443%。

2.3.6 磷脂含量的測定

采用紫外分光光度法測定提取物中磷脂的含量，其標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖7所示。

由圖7可知，測定磷脂的含量標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為y=0.004 5x-0.005，R2=0.998 2。根據(jù)測定3個提取物樣品的吸光度，計(jì)算得出提取物樣品中磷脂含量分別是10.37%，10.41%和10.47%，取3個平行試驗(yàn)樣品結(jié)果的平均值，得出提取物中磷脂的含量是10.42%。

圖6 測定多糖含量標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖7 測定磷脂含量標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.4 磷脂的定性分析

磷脂定性分析的薄層色譜圖如圖8所示，圖中左邊是卵磷脂生化試劑樣，右邊是提取物中磷脂試樣。由圖8可以看出，在硅膠板上，通過磷脂的展開方法，活性成分提取物中的磷脂種類為2種，并且提取物中磷脂試樣和卵磷脂生化試劑樣的展開點(diǎn)位置基本水平，可以判斷提取物中的磷脂成分與卵磷脂生化試劑中磷脂種類基本相同。

圖8 磷脂的薄層色譜圖

2.5 游離脂肪酸的定性分析

利用氣相色譜法對活性成分提取物中的脂肪酸進(jìn)行定性分析，氣相色譜圖見圖9，氣相色譜分析結(jié)果見表5。

圖9 脂肪酸的氣相色譜圖

表5 脂肪酸的氣相色譜分析結(jié)果

由圖9和表5可以看出，活性成分提取物中脂肪酸的種類較多，大部分為不飽和脂肪酸，并且含有ω-3系列不飽和脂肪酸EPA。

3 結(jié)論

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果及正交試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果，魚頭中活性成分的最佳提取工藝條件是攪拌時間15 h、乙醇體積分?jǐn)?shù)75%、料液比1∶4（g/mL）、Na+濃度1%。在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，活性成分提取率為13.57%，影響提取效果因素的大小為料液比＞乙醇體積分?jǐn)?shù)＞攪拌時間。

活性成分提取物中水分含量比較高，蛋白質(zhì)和多糖的含量很低；活性物質(zhì)磷脂和脂肪酸的含量分別是10.42%和26.68%，含量較高。通過薄層色譜定性分析，磷脂的種類為2種，與卵磷脂生化試劑中磷脂種類基本相同；通過氣相色譜定性分析，脂肪酸的種類較多，大部分為不飽和脂肪酸，并且含有ω-3系列不飽和脂肪酸EPA。該研究為魚類產(chǎn)品加工的下腳料魚頭的綜合利用提供理論依據(jù)，具有重要的研究價值。