嬰配乳粉基氯酸鹽和高氯酸鹽標準樣品的研制與評估

李清清，宋瑞，楊軼眉

上海市質量監督檢驗技術研究院，國家食品質量監督檢驗中心（上海）（上海 200233）

乳粉實物標準樣品是帶有乳粉基質的質控樣品，可作為開展檢測方法確認與質量控制的良好工具。根據在全國標準信息公共服務平臺[1]和國家標準物質資源共享平臺[2]查詢，我國目前有乳制品實物標準物質/樣品28種，主要為乳制品中營養物質和菌落標準樣品，但乳制品中有害物質實物標樣研究還很少。楊軼眉等[3]研究了奶粉蛋白質成分分析標準物質，奶粉經復溶、均質、干燥，均勻性良好，穩定性可達1年以上；李筱翠等[4]采用真空冷凍干燥-刀式混合研磨儀粉碎制備脫脂乳粉中硝酸鹽、亞硝酸鹽標樣，其均勻性良好，常溫長期穩定性良好。王向勇等[5]研制了牛乳中二噁英類化合物標準物質，通過冷凍干燥技術進行制備，其均勻性及室溫條件1年內穩定性均良好。

氯酸鹽是對人體有害的消毒副產物，乳粉生產過程所涉及的清洗和消毒都可能造成殘留污染[6]；高氯酸鹽是一種新型持久性化學污染物，飼料和飲水可造成乳粉源頭污染[7]。近幾年嬰配乳粉中氯酸鹽和高氯酸鹽的檢測方法已得到廣泛研究[8-12]，但相關實物標樣的研制國內外尚未有報道。此項目對嬰配乳粉氯酸鹽和高氯酸鹽實物標樣的制備技術進行研究，并對制備的標樣進行評估。制備出的標樣可為檢測技術研究和質量安全分析提供保障，也可應用于分析方法驗證和分析能力考核，同時也為政府監管提供科學、公正的依據和技術支持。

1 試驗部分

1.1 儀器和試劑

1.1.1 儀器與設備

噴霧干燥機（SP-500，上海順儀科技）；真空冷凍干燥機（LGJ-50FG，北京亞星儀科）；刀式混合研磨儀（德國Retsch）；樣品混勻儀（瑞士Wab）；高效液相色譜-串聯質譜儀（Xevo TQ-XS，美國Waters公司）；電子天平（MS204S，瑞士梅特勒托利多儀器公司）；超聲清洗儀（SK8210HC，上海科導超聲儀器有限公司）；渦旋振蕩器（D-91126 Schwabach，德國Heidolph公司）；離心機（Centrifuge 5804，德國Eppendorf公司）。

1.1.2 試劑與材料

超純水（質譜級，Fisher）；乙腈（質譜級，TEDIA）；甲酸（色譜級，TEDIA）；甲酸銨（液質聯用級，ACS恩科）；甲醇（色譜級，MERCK）；氯酸鹽標準溶液（有證標準物質，Inorganic Ventures）；高氯酸鹽標準溶液（有證標準物質，Inorgani c Ventures）；氯酸鹽標準溶液（有證標準物質，SIGMA）；高氯酸鹽標準溶液（有證標準物質，SIGMA）；氯酸鹽同位素內標溶液（美國CIL）；高氯酸鹽同位素內標溶液（美國CIL）；嬰幼兒配方乳粉基粉（某乳粉公司提供）。

1.2 標準樣品的制備

1.2.1 復原乳的配制與目標物質的添加

在超純水中加入氯酸鹽和高氯酸基礎含量明確的嬰幼兒配方乳粉，乳固體含量為33%。按設定添加量依次加入氯酸鹽、高氯酸鹽標準溶液，以100 MPa高壓均質2次。

1.2.2 乳粉的干燥和混勻

為降低對氯酸鹽和高氯酸鹽含量的影響，以進風溫度140 ℃噴霧干燥，得含水率約4.0%的乳粉；再經溫度45 ℃、真空度0.09 MPa真空干燥15 h，得含水率在2%以內的乳粉，樣品取出后使用刀式混合研磨儀粉碎。

1.2.3 封裝

每份包裝實物標準樣品的質量為8 g，采用內袋鋁箔袋密封條包裝、外袋鋁箔袋充氮熱封的雙層包裝分裝樣品。

1.3 標準樣品氯酸鹽和高氯酸鹽含量的檢測

1.3.1 樣品前處理

稱取2 g試樣置于50 mL具塞離心管中，加入氯酸鹽和高氯酸鹽同位素內標液，準確加入5.0 mL 0.1%甲酸水溶液，立即渦旋振蕩5 min，置于45 ℃水浴超聲30 min，再準確加入10.0 mL乙腈，混勻，以10 000 r/min離心10 min，取上清液，過0.22 μm濾膜，待測。

1.3.2 繪制標準曲線

用20 mmol/L甲酸銨-乙腈（1∶2）溶液將標準溶液進行逐級稀釋，加入與樣品提取液等含量的內標溶液，配制成氯酸鹽5，10，20，50和100 μg/L，高氯酸鹽2.5，5，10，25和50 μg/L的混合標準溶液，每個質量濃度點重復測定2次，繪制標準曲線。

1.3.3 高效液相色譜-串聯質譜儀工作條件

色譜柱，Themo Acclaim TRINITY P1（50 mm×2.1mm，3 μm）；柱溫，35 ℃；進樣體積，5 μL；流速，0.3 mL/min；流動相，乙腈（A）-20 mmol/L甲酸銨（B）；梯度洗脫，A-B初始比例68∶2，3 min時變為90∶10；離子源，電噴霧離子源；毛細管電壓，200 V；離子源溫度，150 ℃；脫溶劑溫度，400 ℃；脫溶劑氣流量，900 L/h；錐孔氣流量，150 L/h；采用多反應監測（MRM）模式采集數據。氯酸根定量離子對：母離子m/z83.0，子離子m/z67.0。高氯酸根定量離子對：母離子m/z99.0，子離子m/z83.0。

1.4 標準樣品均勻性檢驗

根據GB/T 15000.3—2008《標準樣品工作導則（3）定值的一般原則和統計方法》[13]要求，在制備的標準樣品中隨機抽取10袋，每袋取2份平行樣品，進行組內均勻性和組間均勻性檢驗，以隨機順序對每份樣品進行重復測定，用單因素方差分析法進行均勻性評估，并計算均勻性引入的不確定度。

1.5 標準樣品穩定性監測

根據GB/T 15000.3—2008《標準樣品工作導則（3）定值的一般原則和統計方法》要求，隨機抽取12份樣品，每3份分別置于-25，0，20和40 ℃的恒溫環境中，在第1，第3和第7天取出進行測定，監測標準樣品的短期穩定性；按照先密后疏的原則，在室溫條件下保存0，0.5，1，3，6和12個月時隨機抽取1袋進行長期穩定性監測，采用t-檢驗法線性回歸趨勢分析，對穩定性監測結果進行評估。

2 結果與討論

2.1 標準樣品制備和封裝工藝的選擇

在乳粉復溶過程中，要考慮原料乳粉的充分溶解性，以便在添加氯酸鹽和高氯酸鹽后能夠達到良好的混合程度，同時又要考慮到后續噴霧干燥所能承受的水分含量。試驗表明，乳粉沖調質量分數在30%～35%時可以達到良好的溶解效果，而不影響后續干燥步驟的實施。

由于乳粉中脂肪和蛋白質含量都相對較高，所以制備的乳粉成品中水分含量不宜過高，以防止儲存過程中的結塊和變質。經過對市售乳粉和噴霧干燥成品的檢測和研究，乳粉水分含量在2%以內時，乳粉黏度適中，易于存放。同時，考慮到高氯酸鹽化學性質相對穩定，而氯酸鹽的氧化性較強，在高溫條件下可能轉化為高氯酸鹽，所以在干燥過程采用低進風溫度噴霧干燥和真空干燥復合干燥技術。首先采用低進風溫度噴霧干燥，使乳粉中的水分含量小于5%，而后用真空干燥技術，使乳粉成品的水分含量小于2%。試驗考察了進風溫度130，135，140和145 ℃時的干燥效果和對目標物質的影響，當進風溫度為130 ℃時，制備的乳粉水分含量在5.3%左右，氯酸鹽損失率最小，但后續的真空干燥過程需在45 ℃、真空度0.09 MPa下進行24 h，才能使乳粉成品的水分含量小于2%；當進風溫度為140 ℃時，制備的乳粉水分含量在4.2%左右，氯酸鹽稍有損失，但損失率不大，而后續的真空干燥過程可縮短至15 h；當進風溫度提高至145℃時，雖然制備的乳粉水分含量減小，但會使氯酸鹽損失增大。故采用進風溫度140 ℃噴霧干燥，45 ℃、真空度0.09 MPa真空干燥15 h作為干燥條件。

在樣品封裝時，考察了真空塑封包裝、瓶裝以及鋁箔袋充氮包裝等3種工藝的儲存效果。結果表明，真空塑封包裝在室溫保存3個月左右時，乳粉發生結塊現象，不適于后續的分析使用；在瓶裝包裝中，雖可長期室溫保存，但是瓶口一旦打開，就很難保證乳粉的長期保存且不結塊變質；采用內袋鋁箔袋密封條包裝，外袋鋁箔袋充氮熱封的雙層包裝分裝樣品，內袋乳粉每袋4 g單獨密封條包裝，便于使用，每2個內袋再采用外袋充氮包裝，便于長期室溫保存。

2.2 標準樣品檢測方法的優化

檢測方法在比較了離子色譜-串聯質譜和高效液相色譜-串聯質譜兩種方法后，采用了穩定性更好、目前應用范圍更廣的高效液相色譜-串聯質譜法，并參考國家補充檢驗方法BJS 201706《食品中氯酸鹽和高氯酸鹽的測定》[14]，對檢測條件進行了優化。

樣品在加入甲酸提取溶液后，要立即進行充分混合，以便乳粉全部溶解，達到良好的提取效果。由于乳粉黏性較大，由液體包裹的乳粉塊如果不充分溶解，會影響結果的精密度，普通的振搖很難使乳粉充分溶解，試驗加入了渦旋振蕩5 min，以達到良好的平行試驗效果。

試驗考察了不同超聲時間（10，20，30和40 min）對結果的影響。結果表明，超聲30 min較10 min和20 min有更好的回收率效果，而超聲40 min時回收率增加不明顯，故采用超聲時間30 min。

試驗對流動相配比進行了研究。BJS 201706中流動相初始比例乙腈（A）-20 mmol/L甲酸銨（B）為35∶65，而后B項逐漸減少至10%，在此條件下，氯酸鹽和高氯酸鹽的出峰較靠后，而后續被沖出的雜質會在目標峰附近形成一定干擾；經試驗研究，將流動相A-B初始比例調整為68∶32，3 min時B項減少至10%，在此條件下，氯酸鹽和高氯酸鹽會較早出峰，而雜質在后續出峰，避免了對目標物質的干擾，同時20 mmol/L甲酸銨比例相對減少，也降低了鹽類對離子源錐口的污染，提高了檢測的長期穩定性。

2.3 標準樣品均勻性檢驗和評估

采用單因素方差分析法，按照優化的檢測條件對標準樣品進行檢測，結果見表1。結果顯示，標準樣品測定結果符合公式FA＜F0.05（9，10），此項研制的實物標準樣品組內與組間無明顯差異，說明標準樣品是均勻的。由于組內方差小于組間方差，所以利用檢測方法重復性方差來評估樣品均勻性引入的不確定度，乳粉樣品中氯酸鹽與高氯酸鹽均勻性引入的不確定度（ubb）分別為1.00和0.456 μg/kg。

表1 嬰幼兒配方乳粉氯酸鹽和高氯酸鹽實物標準樣的均勻性檢驗結果

2.4 標準樣品短期穩定性監測和評估

采用線性回歸趨勢分析t-檢驗法，對其短期穩定性進行監測，結果見表2。短期穩定性監測的目的主要是考察標準樣品在后續使用時，運輸過程是否會對目標物質造成影響。考慮到環境溫度的高溫和低溫，以及運輸時間，試驗考察了-25，0，20和40 ℃時保存1周的影響。結果表明，在4個溫度條件下，標準樣品中氯酸鹽和高氯酸鹽穩定性良好。

表2 標準樣品短期穩定性監測結果和統計參數

2.5 標準樣品長期穩定性監測和評估

采用線性回歸趨勢分析t-檢驗法，按照預定的時間間隔，對標準樣品的長期穩定性進行監測，結果見表3。由于氯酸鹽和高氯酸鹽在常溫下化學性質相對穩定，所以主要考察室溫條件下標準樣品的儲存效果。在12個月的監測周期內，標準樣品氯酸鹽和高氯酸鹽特性值帶入結果均為│b1│＜t(0.95,4)×s(b1)，表明標準樣品目標成分在12個月內不具備長期變化趨勢。

表3 標準樣品長期穩定性監測結果和統計參數

2.6 標準樣品制備回收率的評估

對原料乳粉和經過基質添加制備的乳粉標準樣品進行氯酸鹽和高氯酸鹽檢測，為了排除檢測過程中回收率對結果造成的影響，對測得結果均進行加標回收率校正，結果見表4。結果表明，標準樣品中氯酸鹽和高氯酸鹽的測得值與實際添加值較為吻合，制備回收率分別為93.5%和98.4%。

表4 標準樣品的制備回收率

3 結論

此次試驗制備了嬰幼兒配方乳粉氯酸鹽和高氯酸鹽標準樣品，經乙腈沉淀蛋白-高效液相色譜-串聯質譜法檢測氯酸鹽和高氯酸鹽含量，采用單因素方差分析法進行均勻性評估，結果符合FA＜F0.05（r-1,n-r），采用線性回歸趨勢分析t-檢驗法進行穩定性評估，結果符合│b1│＜t(0.95,n-2)×s(b1)，氯酸鹽和高氯酸鹽的制備回收率分別為93.5%和98.4%，證明所制備的標準樣品具有氯酸鹽和高氯酸鹽含量均勻、短期和長期穩定性良好、目標制備值與實際檢測值相吻合的優點，可作為嬰幼兒配方乳粉氯酸鹽和高氯酸鹽檢測的對照標準樣品。