響應面分析法優化美國黑莓花青素提取工藝

吳哲，劉冠群，張嬌，馮夏珍，葉松華，阮文輝

1. 山西省藥品檢查中心（太原 030031）；2. 山西省醫藥與生命科學研究院（太原 030016）

美國黑莓（Rubus subgenusRubus Watson）是薔薇科懸鉤子屬植物，原產于美洲，1986年引入我國，在江蘇、安徽、湖南、湖北、山東、重慶、四川等地區大范圍引種栽培，產生可觀的農業經濟價值[1]。與樹莓比較，美國黑莓有更強的抗逆性和抵抗蟲害能力，適應能力強，易于種植推廣。作為世界糧農組織推薦的第三代水果，黑莓含有維生素C、17種人體必需氨基酸、豐富的花青素，營養價值豐富[2]。

花青素又稱為花色素，隨著酸堿度改變其顏色在紅色、藍色和無色之間轉變。花青素是具有C6—C3—C6碳骨架結構類黃酮化合物，自然狀態下通過糖苷鍵與糖類連接形成花色苷并不以單體狀態存在[3]。花青素有多方面生物功能，可將體內的超氧自由基還原并清除，具有抗氧化作用[4]；花青素經過酰基化的修飾后，可有效地抑制雜環化合物（如吲哚、咪唑、喹啉類物質）引起的突變作用[5]；通過激活其抗氧化防御體系可預防老年退化性疾病并有延緩衰老的作用功效[6]；通過抑制脂肪酸和三酰甘油合成相關酶的mRNA水平，改善肥胖和高血糖[7]。

美國黑莓的研究集中在引種栽培方面，對果實中花青素涉及較少。提取果實的花青素常以酸化醇作為提取劑，提取時間、溫度、料液比、pH等均會對提取率有交叉影響[8-10]。試驗旨在以響應面法對美國黑莓花青素提取進行工藝優化，得到操作性強、高效明確的提取方法，為其深層次開發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 儀器和設備

超聲波清洗器（QC1026，深圳市臻潔康科技實業有限公司）；紫外可見分光光度計（AUW220D，Thermo Fisher Scientific-CN）；真空泵（SHZ-IIID，上海知信儀器技術有限公司）；電子天平（BSN-220.3，上海卓精電子科技有限公司）；精密pH計（PB-10，賽多利斯科技儀器有限公司）；電熱恒溫水浴鍋（HH-6，北京市長風儀器儀表公司）。

1.2 材料和試劑

美國黑莓果實（采自江蘇南京于-20 ℃冷凍保藏）。

鹽酸、氫氧化鉀（北京試劑化工廠）；無水乙醇（國藥集團化學試劑有限公司）；氯化鉀、無水乙酸鈉、檸檬酸（天津市風船化學試劑有限公司）；冰乙酸（天津市恒興化學試劑制造有限公司）；試劑均為分析純。

1.3 試驗方法

1.3.1 花青素的提取

配制緩沖液：0.2 mol/L氯化鉀和0.2 mol/L鹽酸，二者體積比50∶134，用冰醋酸調至pH 1.0；使用1 mol/L醋酸鈉，以醋酸調至pH 4.5。

用勻漿機將美國黑莓粉碎呈漿狀，用電子分析天平稱取2.00 g樣品于100 mL棕色具塞三角瓶中，加入酸性乙醇（鹽酸含量3.65%，pH 3），搖勻，于功率240 W超聲清洗機中超聲浸提一段時間。將其提取液抽濾，得到濾液。取2份1 mL濾液，分別用pH 1.0、pH 4.5緩沖溶液按1∶25定容待測。

1.3.2 花青素含量的測定

采用pH示差法[11]進行含量測定。pH變化會影響花青素結構，在pH 1時波長512 nm處有最大吸收峰，在pH 4.5時花青素轉化為無色的甲醇假堿。分別在512和700 nm處測定提取液的吸光度大小，計算如式（1）所示。

式中：C為提取液中花青素的含量，mg/g；M為標準物質矢車菊素-3-葡萄糖苷的相對分子質量，449.2；A0為A512nm-A700nm，pH 1.0；A1為A512nm-A700nm，pH 4.5；V為提取液總體積，mL；n為提取液稀釋倍數；m為樣品質量，g；ε為Cy-3-Glu消光系數，26 900。

1.3.3 花青素提取的單因素試驗

按1.3.1方法，固定其余條件不變，研究不同提取時間、溫度、液料比、乙醇體積分數等因素對美國黑莓花青素提取效果的影響。

1.3.3.1 提取時間對花青素含量的影響

在液料比20∶1（mL/g）、提取溫度35 ℃、乙醇體積分數75%條件下，考察不同提取時間（20，30，40，50和60 min）對花青素提取效果的影響。

1.3.3.2 提取溫度對花青素含量的影響

在液料比20∶1（mL/g）、提取時間30 min、乙醇體積分數75%條件下，考察不同提取溫度（25，35，45，55和65 ℃）對花青素提取效果的影響。

1.3.3.3 酸性乙醇體積分數對花青素含量的影響

在液料比20∶1（mL/g）、提取時間35 min、提取溫度30 ℃條件下，考察不同乙醇體積分數（30%，45%，60%，75%和90%）對花青素提取效果的影響。

1.3.3.4 液料比對花青素含量的影響

在提取時間35 min、提取溫度30 ℃、乙醇體積分數75%條件下，考察不同液料比（5∶1，10∶1，15∶1，20∶1和25∶1 mL/g）對花青素提取效果的影響。

1.3.4 響應面優化試驗設計

以單因素試驗結果為依據，考慮實際生產效率，選取體積分數、液料比和提取溫度為自變量，以花青素含量為響應值，根據Box-Behnken試驗設計，優化乙醇超聲提取美國黑莓花青素的最佳工藝參數。試驗的因素與水平設計見表1。

表1 響應面設計的因素和水平

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 提取時間對花青素含量的影響

如圖1所示，在25～35 min之間，花青素含量隨著時間增加而提高。35 min之后含量逐漸下降，說明花青素含量經過35 min超聲提取達到最高，溶液基本飽和。花青素本身并不穩定，極易被空氣氧化。提取時間繼續增長，其含量反而下降。考慮到實際生產應用，最佳提取時間選擇35 min。

圖1 提取時間對花青素含量的影響

2.1.2 提取溫度對花青素含量的影響

如圖2所示，在20～30 ℃之間，花青素含量隨著溫度升高而提高，在30 ℃時花青素含量達到最高。30～60 ℃之間曲線呈下降趨勢，花青素含量逐漸降低。相關研究表明，隨著溫度升高，花青素3-糖苷結構會加快水解，而此結構對維持花青素穩定性至關重要[12]。經過勻漿，花青素并不穩定，果醬與提取液接觸面積較大，而花青素在較高溫度下極易分解。提取溫度過低會導致溶解度低不利于花青素溶解。

圖2 提取溫度對花青素含量的影響

2.1.3 乙醇體積分數對花青素含量的影響

如圖3所示，乙醇體積分數在30%～60%內，花青素含量逐漸上升。乙醇體積分數為75%時，花青素含量最大。乙醇體積分數大于75%時，花青素含量緩慢下降。提取液隨著乙醇體積分數上升，其親水性逐漸下降，而親脂性增強，極性逐漸減弱。根據相似相溶的原理，花青素極性大，易溶于極性較強的溶液[13]，在乙醇體積分數較低情況下，黑莓中糖類親水性強，更容易溶解。乙醇體積分數達到75%時，花青素極性與溶液極性接近，溶解性最佳。體積分數上升更高，提取液極性下降，花青素溶解能力下降，且黑莓中極性稍低的物質在乙醇溶解能力上升，導致花青素含量略有下降。

圖3 乙醇體積分數對花青素含量的影響

2.1.4 液料比對花青素含量的影響

如圖4所示，液料比在5∶1～20∶1（mL/g）內，花青素含量較快上升。液料比達到20∶1（mL/g）時，花青素含量最高。液料比大于20∶1（mL/g）后，花青素含量略有減小。隨著液料比提高，黑莓果漿與溶劑能夠充分接觸，利于花青素溶解[14]。液料比大于20∶1（mL/g）后，花青素含量下降，可能由于花青素主要存在于美國黑莓植物細胞液泡和細胞質之中，使用超聲提取能夠破壞植物的細胞壁和細胞膜，利于花青素的溶出。在液料比較大情況下，單位體積內的美國黑莓勻漿濃度下降。由于超聲提取功率沒有改變，對果漿的作用力減弱因而減緩單位時間內花青素溶出。

圖4 液料比對花青素含量的影響

2.2 響應面試驗的結果與分析

2.2.1 響應面優化美國黑莓花青素提取條件試驗結果

在單因素試驗基礎上，根據Box-Behnken中心組合試驗原理，進行試驗設計。共有17個試驗點，其中12個析因試點，5個中心試點。試驗結果見表2，回歸方程的方差分析結果見表3。

表2 響應面試驗設計以及結果

使用Design-Expert 8.0.6對表2數據進行多元回歸擬合，可以得到美國黑莓花青素含量對乙醇體積分數、液料比、提取溫度之間關系的二次多項式回歸方程：Y=2.54+0.071X1+0.22X2+0.11X3+0.2X1X2-0.035X1X3+0.075X2X3-0.1X12-0.33X22-0.094X32。

表3 回歸方程方差分析結果

表3中，乙醇體積分數、液料比、提取溫度的一次項和二次項，以及乙醇體積分數與液料比交互項均達到極為顯著水平（p＜0.01）；液料比與提取溫度交互項達到顯著水平（p＜0.05）。對一次項系數絕對值F進行比較可知，3種因素對花青素含量影響排序為液料比＞提取溫度＞乙醇體積分數。

2.2.2 花青素含量響應曲面分析

用Design-Expert 8.0.6建立X1、X2、X3對響應值Y構成的響應面圖及由其投影形成等高線圖。如圖5（A）所示，在溫度30 ℃條件下，考察乙醇體積分數與料液比的交互作用；如圖5（B）所示，在液料比20∶1（mL/g）條件下，考察乙醇體積分數與提取溫度的交互作用；如圖5（C）所示，在乙醇體積分數70%條件下，考察液料比與提取溫度的交互作用。

圖5 各因素交互作用影響的曲面圖和等高線圖

等高線可直觀反映兩兩因素對花青素含量交互作用，等高線如果呈圓形表示二者交互作用不顯著，如果是橢圓形或馬蹄形表示交互作用顯著[15]。在一定響應值范圍內，等高線越密集，表示交互作用越不顯著，反之，稀疏表示交互作用越顯著[16-17]。曲面圖中坡度越陡峭，表明響應值受條件因素的影響越大；反之曲面坡度越趨于平緩，其響應值受條件因素改變的影響也就越小[18]。

圖5中（A）與（C）等高線呈橢圓形，與（B）相比等高線較稀疏、中心點顏色深。說明乙醇體積分數和液料比、提取溫度、液料比交互作用顯著。圖5中（B）等高線近似于圓形，故乙醇體積分數和提取溫度交互作用不顯著。比較3個曲面圖可知，液料比對花青素含量影響最大，其曲線坡度最為陡峭，與方差分析的結果一致。

以花青素含量最高為目標，使用Design-Expert 8.0.6進行分析，所得最優工藝參數為乙醇體積分數88.42%、液料比23.42∶1（mL/g）、提取溫度36.90℃，此條件下花青素含量為2.68 mg/g。據實際生產將工藝條件修正為乙醇體積分數88%、液料比23∶1（mL/g）、提取溫度37 ℃，在此條件下做3次平行試驗，花青素平均含量2.61 mg/g與模型預測基本相符。

3 結論與展望

在提取時間、提取溫度、乙醇體積分數、液料比的單因素試驗基礎上，通過Box-Behnken設計及響應面試驗，得出美國黑莓提取花青素最佳工藝條件：乙醇體積分數88%、液料比23∶1（mL/g）、提取溫度37 ℃。此時花青素含量為2.61 mg/g，與預測值（2.68 mg/g）接近，該模型能較好預測花青素的含量。

因人工合成色素對人體具有危害，食品工業中天然色素的開發越來越受到重視。花青素是一類非常有實用價值天然色素。曾有研究將花青素4號位上用甲基或酚基代替，以解決花青素不穩定的應用瓶頸[19]。花青素中如花生衣色素、桑葚紅色素、紅球甘藍色素等已經在食品工業中廣泛應用，且由于其具有抗菌作用，還起到一定防腐劑功能[20]。美國黑莓引入中國多年，對其花青素應用研究鮮有報道。試驗通過優化美國黑莓花青素提取條件，為其進一步純化后在食品、保健食品領域的應用提供參考依據。