安琪復合菌應用于傳統老陳醋酒精發酵工藝優化

丁偉，田莉，閆裕峰，郎繁繁，梁楷，張思敏

1. 山西紫林醋業股份有限公司（太原 030400）；2. 山西省食品工業研究所（太原 030024）

酸、甜、苦、咸是人體的四種基本味覺[1]，其中以酸居首位，而日常生活中提供酸味的調味品絕大多數被食醋所包攬，由此可見食醋在人們日常生活中的地位之高。山西老陳醋以高粱、麩皮為主要原料，大曲為糖化發酵劑，經“蒸、酵、熏、淋、陳”等工序釀制而成，具有“酸、綿、甜、香、鮮”的風味特征，居四大名醋之首[2-5]。

制醋先制酒，好酒出好醋，酒精發酵工藝是老陳醋制作的基礎工序，酒醪品質的好壞直接影響老陳醋的質量[6-8]。傳統的老陳醋酒精發酵工藝以大曲為糖化發酵劑，大曲富含自然界的多種微生物，發酵產酒的同時能賦予酒醪多種風味物質。但大曲生產過程是自然接種，氣候和環境等因素對其微生物種類、數量及質量有較大影響，因而容易造成生產批次間的較大差異，且發酵時間較長，不利于產量和質量的穩定[9-13]。

安琪復合菌（簡稱復合菌）由多種微生物菌種復合培養而成，通過合理使用，穩定酒醪酒精度的同時能顯著增加酒精發酵階段的風味物質含量，提高酒醪質量。

氨基酸態氮是國家標準中限定最低含量的一個指標，其能為食醋提供特殊的鮮味[14-15]。試驗以糧水比、大曲添加量、復合菌添加量和發酵時間為考察因素，以酒精度與氨基酸態氮為考察指標，通過單因素試驗和響應面優化試驗，以酒醪酒精度和氨基酸態氮為考察指標，得到安琪復合菌應用于傳統老陳醋酒精發酵的最佳工藝條件，可為傳統老陳醋生產提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

高粱（市售）；大曲（山西紫林醋業股份有限公司自制）；安琪復合菌（安琪酵母股份有限公司）；甲醛、氫氧化鈉（分析純，天津歐博凱化工有限公司）。

1.1.2 儀器與設備

ALKOMAT酒精檢測儀：福林斯（徐州）生化技術有限公司；AR124CN電子天平、ZL-002 pH計（奧豪斯儀器有限公司）；78-1型磁力電熱攪拌器（江蘇榮華儀器制造有限公）司。

1.2 試驗方法

1.2.1 安琪復合菌應用于傳統老陳醋酒精發酵工藝流程及操作要點

操作要點：選取飽滿、無雜質、無霉變的高粱，粉碎后用50 ℃的溫水潤料12 h，然后蒸熟、攤涼、冷卻至30 ℃，加入大曲和復合菌拌勻，轉入發酵缸，加一定比例的水攪拌均勻后開始發酵。前3 d為敞口發酵，其后封缸密閉發酵。

1.2.2 安琪復合菌應用于傳統老陳醋酒精發酵工藝優化單因素試驗

糧水比的確定：以高粱用量為參照，選取糧水比1∶1.0，1∶2.0，1∶3.0，1∶4.0和1∶5.0（kg/kg），大曲添加量50%，復合菌添加量0.30%，發酵時間16d，進行老陳醋酒精發酵，以酒精發酵結束時酒醪的酒精度及氨基酸態氮含量為檢測指標，進行單因素試驗，每個處理重復3次。

大曲添加量的確定：以高粱用量為參照，選取糧水比1∶4.0（kg/kg），大曲添加量30%，40%，50%，60%和70%，復合菌添加量0.30%，發酵時間16 d，進行老陳醋酒精發酵，以酒精發酵結束時酒醪的酒精度及氨基酸態氮含量為檢測指標，進行單因素試驗，每個處理重復3次。

復合菌添加量的確定：以高粱用量為參照，選取糧水比1∶4.0（kg/kg），大曲添加量為50%，復合菌添加量0.00%，0.10%，0.20%，0.30%和0.40%，發酵時間16 d，進行老陳醋酒精發酵，以酒精發酵結束時酒醪的酒精度及氨基酸態氮含量為檢測指標，進行單因素試驗，每個處理重復3次。

發酵時間的確定：以高粱用量為參照，選取糧水比1∶4.0（kg/kg），大曲添加量50%，復合菌添加量0.30%，發酵時間10，12，14，16和18 d，進行老陳醋酒精發酵，以酒精發酵結束時酒醪的酒精度及氨基酸態氮含量為檢測指標，進行單因素試驗，每個處理重復3次。

1.2.3 安琪復合菌應用于傳統老陳醋酒精發酵工藝響應面法優化試驗

在單因素試驗基礎上，根據Box-Behnken中心組合設計原理，以糧水比（A）、大曲添加量（B）、復合菌添加量（C）及發酵時間（D）為試驗因素，以酒精發酵結束時酒醪的酒精度（Y1）及氨基酸態氮含量（Y2）為響應值，設計四因素三水平29個試驗點的響應面分析試驗，進行老陳醋酒精發酵工藝優化。試驗因素與水平見表1。

表1 Box-Behnken試驗因素與水平

1.2.4 酒精度測定

取100 mL發酵結束時的酒醪，加100 mL蒸餾水，用容量瓶收集100 mL蒸餾液，用ALKOMAT酒精檢測儀測定酒精度。

1.2.5 氨基酸態氮含量測定

按照GB/T 19777—2013《地理標志產品 山西老陳醋》[14]進行測定。

1.3 數據處理方法

運用Excel 2010進行數據整理，SPSS 19.0進行單因素分析，Design-Expert.V 8.0.6.1進行響應面試驗設計與分析。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 糧水比對老陳醋酒精發酵的影響

由表2可知，當糧水比為1∶3.0（kg/kg）與1∶4.0（kg/kg）時，老陳醋酒精發酵結束時酒醪的酒精度與氨基酸態氮含量均極顯著高于其他比例的結果（p＜0.01），且二者間差異不顯著（p＞0.05），這表明糧水比過低或過高均不利于酒醪各指標的提高，原因可能是當糧水比過低時，醪液濃稠度過高，流動性降低，微生物活動受限，進而導致發酵不徹底，使得相關理化指標難以提高；當糧水比過高時，醪液被稀釋，從而使相關理化指標降低。因此，最佳糧水比為1∶4.0（kg/kg）。

表2 糧水比對老陳醋酒精發酵的影響

2.1.2 大曲添加量對老陳醋酒精發酵的影響

大曲是一種常見的糖化發酵劑，含有多種復雜的微生物，能將原料中的淀粉經過液化、糖化及酒精發酵最終轉化為酒精，也能分解部分蛋白質累物質[16-18]。由表3可知，當大曲添加量從30%增加到60%時，酒醪的酒精度與氨基酸態氮含量均極顯著增加（p＜0.01）；當大曲添加量繼續增加到70%時，酒醪的酒精度與氨基酸態氮含量無顯著變化（p＞0.05）。因此，大曲的最適添加量為60%。

表3 大曲添加量對老陳醋酒精發酵的影響

2.1.3 復合菌添加量對老陳醋酒精發酵的影響

安琪復合菌含有多種高純度的強化復合菌種，能增加酒精發酵階段風味物質（氨基酸態氮）的含量。由表4可知，當復合菌添加量從0.00%增加到0.30%時，酒醪的酒精度與氨基酸態氮含量均極顯著增加（p＜0.01）；當復合菌添加量繼續增加到0.40%時，酒醪的酒精度與氨基酸態氮含量無顯著變化（p＞0.05）。因此，復合菌的最適添加量為0.30%。

表4 復合菌添加量對老陳醋酒精發酵的影響

2.1.4 發酵時間對老陳醋酒精發酵的影響

試驗發現，傳統老陳醋酒精發酵前3 d，酒醪酒精度基本達到最大值，后期主要是養醪階段，以增加風味物質含量[19-21]。由圖1可知，當發酵時間從3 d增加到16 d時，酒醪的酒精度變化不明顯，而氨基酸態氮含量極顯著增加（p＜0.01），當發酵時間繼續增加到18 d時，酒醪的酒精度和氨基酸態氮含量均開始降低。因此，最適發酵時間為16 d。

2.2 傳統老陳醋酒精發酵工藝優化響應面試驗

試驗設計及結果見表5。

使用Design-Expert.V 8.0.6.1軟件對表5的結果進行分析，對數據進行多元回歸擬合，得到酒精度（Y1）及氨基酸態氮（Y2）的二次多項回歸方程：

圖1 發酵時間對老陳醋酒精發酵的影響

表5 Box-Behnken試驗設計及結果

由表6可知，以酒精度為響應值構建的模型的p＜0.000 1，達到了極顯著水平；失擬項的p=0.059 9＞0.05，不顯著，故試驗不存在失擬因素，可反映實際情況，所選模型適宜。決定系數R2=98.68%，調整決定系數R2Adj=97.37%，表明回歸模型能良好擬合試驗數據，模型可靠，可用來分析和預測試驗結果。根據方差分析結果可知，模型中的一次項A、D及二次項A2、D2對結果影響極顯著（p＜0.01），其他項對結果影響不顯著（p＞0.05）。根據回歸方程得到各因素間的交互作用對酒精度影響的響應曲面及等高線，見圖2。響應曲面的圖形坡度越陡峭，代表該因素對酒精度的影響越大，反之，坡度平緩則表明影響較小。由圖2可知，影響酒精度的各因素主次順序為糧水比＞發酵時間＞復合菌用量＞大曲用量，與表6的方差分析結果一致。

由表6可知，以氨基酸態氮為響應值構建的模型的p＜0.000 1，極顯著。失擬項p=0.331 3＞0.05，不顯著。決定系數R2=95.60%，校正決定系數R2Adj=91.19%，表明擬合程度良好，可用此模型對該試驗進行分析和預測。方差分析結果顯示，一次項A、C與二次項A2、B2對結果影響極顯著（p＜0.01），一次項B、交互項AB對結果影響顯著（p＜0.05），其他項對結果影響不顯著（p＞0.05）。各影響因素交互作用的響應面曲線見圖3。各因素對氨基酸態氮影響的主次順序為糧水比＞復合菌用量＞大曲用量＞發酵時間，與表6的方差分析結果一致。

表6 回歸方程方差分析

圖2 糧水比、大曲添加量、復合菌添加量和發酵時間對酒精度影響的響應曲面與等高線

圖3 糧水比、大曲添加量、復合菌添加量和發酵時間對氨基酸態氮影響的響應曲面與等高線

運用Design-Expert.V 8.0.6.1軟件，通過響應面法分析試驗，求得酒精度（Y1）及氨基酸態氮（Y2）的二次多項回歸方程的最優解，試驗的最佳工藝參為糧水比1∶3.49（kg/kg）、大曲添加量59.07%，復合菌添加量0.40%，發酵時間14.06 d，該條件下酒精發酵結束時酒醪的酒精度理論值為9.01%vol，氨基酸態氮為0.90 g·100 mL-1。為便于實際操作，將工藝參數修正為糧水比1∶3.5（kg/kg）、大曲添加量59%，復合菌添加量0.40%，發酵時間14 d。采用修正后的工藝參數進行3次重復試驗，測得酒醪酒精度平均值為8.97%vol，氨基酸態氮平均值為0.88 g·100 mL-1，與預測值基本一致，因此采用響應面法預測傳統老陳醋酒精發酵工藝參數是可行的。同時測定最佳工藝參數條件下不添加復合菌的酒醪酒精度，為7.13%vol，氨基酸態氮含量為0.15 g·100 mL-1。計算可知，優化工藝比傳統工藝酒醪酒精度提高了25.81%，氨基酸態氮含量提高了4.87倍，表明添加復合菌能有效提高傳統老陳醋酒精發酵的酒精度和氨基酸態氮含量，作用顯著。

2.3 添加復合菌對半成品老陳醋理化指標的影響試驗

以試驗確定的最佳工藝條件及最佳工藝參數條件下不添加復合菌為對照，進行老陳醋醋酸發酵試驗，檢測半成品老陳醋理化指標，結果見表7。添加復合菌能顯著提高半成品老陳醋的總酸、氨基酸態氮和總酯含量，分別較不添加提高了7.14%，126.67%和40.21%。

表7 老陳醋理化指標檢測結果

3 結論

通過單因素試驗及響應面優化試驗，得到了傳統老陳醋酒精發酵優化工藝：糧水比1∶3.5（kg/kg）、大曲添加量59%，復合菌添加量0.40%，發酵時間14 d。在此條件下，得到的酒醪酒精度為8.97%vol，氨基酸態氮為0.88 g·100 mL-1，與不添加復合菌相比，酒精度提高了25.81%，氨基酸態氮含量提高了4.87倍，所釀造的老陳醋總酸、氨基酸態氮及總酯含量分別提高了7.14%，126.67%和40.21%。此次試驗可為傳統老陳醋生產提供科學依據。