檀琪,阮文輝,楊官娥,劉海萍,郭素萍,王進東,
1. 山西醫科大學藥學院(太原 030001);2. 山西省醫藥與生命科學研究院(太原 030001);3. 山西省藥品監督管理局技術審評中心(太原 030001)
樺褐孔菌(Inonotus obliquus)又稱白樺茸,是一種藥用真菌[1-4],主要分布在歐洲及北美地區[5]。樺褐孔菌的主要成分有三萜類、多糖類、甾類、多酚類等[6-11]。樺褐孔菌是一種天然的藥食兩用型真菌,近年來國內外研究人員對樺褐孔菌的提取分離技術及藥效等研究越來越重視,關于樺褐孔菌化學成分的研究較多,其中三萜類成分不僅是樺褐孔菌子實體中的主要成分,也是其活性成分[12-14]。研究顯示,樺褐孔菌里的三萜類成分具有抗腫瘤、降血糖、降血脂、抗氧化、增強免疫活性等功能,同時具有結構簡單、分子量小、毒副作用小等優點[15-20]。
原料經過提取得到的粗提物化學成分較為復雜,需要進行進一步分離純化,常見三萜類化合物的純化方法有大孔樹脂、ODS柱、硅膠、凝膠色譜法等[21-24]。三萜類化合物分離純化最常用的方法是色譜法,亦是最有效的方法。大孔吸附樹脂色譜是一種不含交換基團、有大孔結構的有機高聚物吸附劑,具有吸附和分子篩雙重作用,因其成本低、吸附容量大、選擇性好、樹脂再生簡便、解吸容易、洗脫率高、可再生等優點,在工業純化有效成分領域應用越來越廣泛[25-27]。此次試驗采用大孔樹脂對樺褐孔菌粗提物進行純化,得到一種高效、快速、可靠的樺褐孔菌中三萜類化合物的提取、富集工藝,為樺褐孔菌的進一步開發利用奠定基礎。
樺褐孔菌子實體粉末(安徽亳州);白樺脂醇對照品(HPLC純度>97.6%,Chroma Dex,批號20151008)。香草醛(分析純,天津市光復精細化工研究所);冰醋酸、高氯酸、異丙醇、乙酸乙酯、甲醇、乙醇(均為分析純,天津市風船化學試劑科技有限公司);AB-8、DM130、D101、HPD100、LSA-21大孔樹脂(西安藍曉科技有限公司)。
BIOMATE 3S紫外-可見分光光度計(Thermo Fisher);BSN-220.3電子天平(北京塞多利斯有限公司);HH-6電熱恒溫水浴鍋(北京市長風儀器儀表公司);GZX-9140電熱鼓風干燥箱(上海博迅實業有限公司醫療設備廠);LYNX-6000離心機(Thermo Fisher);振動式藥物超微粉碎機(濟南倍力粉技術工程有限公司)。
1.3.1 樺褐孔菌總三萜粗提物的制備
在前期研究基礎上[28],取干燥后的樺褐孔菌粉末,加22倍的異丙醇于80 ℃回流提取1次,時間為2.5 h,離心(3 500 r/min,10 min),備用。
1.3.2 三萜類化合物檢測
采用紫外-可見分光光度法[29]。準確稱取4.0 mg干燥恒質量的白樺脂醇對照品于25 mL的容量瓶中,加入無水乙醇溶解,稀釋至刻度搖勻,即可得到質量濃度0.16 mg/mL的對照品溶液。精確吸取0.1,0.15,0.25,0.30,0.35,0.40,0.50和0.55 mL白樺脂醇對照品溶液,分別置于10 mL具塞試管,在100 ℃水浴上蒸干后加入0.20 mL新配制的5 g/100 mL香草醛-冰乙酸溶液和0.80 mL高氯酸溶液,搖勻,于70 ℃水浴保溫反應15 min,冷卻至室溫,再加入乙酸乙酯定量至5 mL,搖勻,同時作試劑空白,在550 nm處測定吸光度,以白樺脂醇質量(μg)為橫坐標,吸光度為縱坐標繪制標準曲線:Y=0.008 5X-0.021 9,R2=0.999 4。用于三萜類化合物的檢測。
1.3.3 靜態吸附-解吸試驗
1.3.3.1 靜態吸附試驗
分別準確稱取1.00 g預處理好的大孔樹脂(AB-8、D101、DM130、HPD100、LSA21)于100 mL錐形瓶中,分別加入50 mL已測定質量濃度的樺褐孔菌三萜樣品液,置于搖床中以100 r/min振蕩12 h,吸附平衡后過濾,測定吸光度并計算溶液中三萜類化合物質量濃度。計算5種樹脂對三萜類化合物的比吸附容量以及吸附率。按式(1)和式(2)計算。
式中:Qe為比飽和吸附量,mg/g;C0為吸附前樣液質量濃度,mg/mL;V0為吸附前樣液體積,mL;C1為吸附過濾后樣液質量濃度,mg/mL;V1為吸附過濾后樣液體積,mL;M為大孔樹脂質量,g。
1.3.3.2 靜態解吸試驗
將按1.3.3.1項下吸附飽和的樹脂加入140 mL質量分數為90%的乙醇中,置于搖床中以100 r/min振蕩12 h進行解吸,過濾測定吸光度并計算溶液中三萜類化合物質量濃度,計算5種樹脂對三萜類化合物的解吸率。按式(3)計算。
式中:C0為吸附前樣液質量濃度,mg/mL;V0為吸附前樣液體積,mL;C1為吸附過濾后樣液質量濃度,mg/mL;V1為吸附過濾后樣液體積,mL;C2為解吸液質量濃度,mg/mL;V2為解吸過濾后樣液體積,mL。
1.3.4 動態吸附-解吸試驗
1.3.4.1 動態吸附泄漏曲線的繪制
準確稱取10 g預處理好的大孔樹脂,裝入玻璃柱中,將質量濃度為0.2 mg/mL樺褐孔菌三萜粗提液以1 mL/min的流速進行連續上樣,收集流出液(每1 BV為1份),測定每份流出液的吸光度,計算流出液中總三萜的含量,以流出液體積為橫坐標,有效物質質量濃度為縱坐標,繪制大孔樹脂動態吸附泄漏曲線。
1.3.4.2 上柱液質量濃度對吸附效果的影響
準確稱取10 g預處理好的大孔樹脂,分別裝入玻璃柱中,以對三萜類化合物吸附量為考察指標,取1.3.1項下樣品溶液,分別稀釋至質量濃度為0.02,0.05,0.1,0.15和0.2 mg/mL,共5份,相同流速上柱,測定吸附后的吸光度并計算溶液中三萜化合物的含量,以分析樣品質量濃度對大孔樹脂吸附的影響。
1.3.4.3 上柱流速對吸附效果的影響
準確稱取10 g預處理好的大孔樹脂,分別裝入玻璃柱中,取相同體積和質量濃度三萜化合物樣品溶液,分別以1.0,2.0和3.0 mL/min的流速上進行上樣,收集流出液(每1 BV為1份),測定每份流出液的吸光度,計算流出液中總三萜的含量,以分析上樣流速對大孔樹脂吸附的影響。
1.3.4.4 洗脫劑體積分數對解吸率的影響
準確稱取10 g預處理好的大孔樹脂,分別裝入玻璃柱中,裝柱按優選的上樣量進行動態吸附,待吸附完成后,分別以體積分數30%,50%,60%,70%和90%的乙醇溶液以2 mL/mim進行洗脫,收集流出液(每1 BV為1份),測定每份流出液的吸光度,計算洗脫液中總三萜的含量,以分析洗脫劑體積分數對解吸效果的影響。
1.3.4.5 洗脫劑用量對解吸率的影響
準確稱取10 g預處理好的大孔樹脂,分別裝入玻璃柱中,按優選的上樣量進行動態吸附,待吸附完成后,用60%乙醇溶液洗雜2 BV,加入體積分數為90%乙醇進行洗脫,收集流出液(每1 BV為1份),測定每份流出液的吸光度,計算洗脫液中總三萜的含量,以分析洗脫劑用量對解吸效果的影響。
1.3.4.6 洗脫流速對解吸率的影響
準確稱取10 g預處理好的大孔樹脂,徑高比為1∶4,分別裝入玻璃柱中,按優選的上樣量進行動態吸附,待吸附完成后,分別以1.0,2.0和3.0 mL/min的流速進行洗脫,收集流出液(每1 BV為1份),測定每份流出液的吸光度,計算洗脫液中總三萜的含量,以分析洗脫劑流速對解吸效果的影響。
篩選合適的樹脂是大孔吸附樹脂分離純化的第一步,亦是關鍵步驟之一。根據大孔樹脂分離純化的基本原理,選取了5種樹脂進行試驗,以靜態吸附法對樹脂進行篩選,結果如表1所示。LSA21對樺褐孔菌三萜的吸附率較低,HPD100、LSA21和D101解吸率明顯低于其他2種樹脂;相對來說,AB-8具有較好的吸附性能和解吸性能,比飽和吸附量為9.67 mg/g,解吸率為87.09%。因此,選擇AB-8樹脂進行下一步的動態吸附-解吸試驗。
在大孔樹脂動態吸附過程中,當上樣條件一定時,上樣液流過樹脂,三萜類化合物會被樹脂吸附,經過一定時間,三萜類化合物在樹脂與上樣液中分配達到平衡,即溶液中的三萜類化合物不斷被樹脂吸附,同時吸附在樹脂上的三萜類化合物又不斷脫附,當吸附達到平衡時,出現泄漏[30]。在樹脂吸附過程中,一般認為泄漏點為流出溶液中三萜類化合物濃度為原上樣濃度的1/10時對應的流出液體積。由圖1可知,當流出液體積為4 BV時,出現泄漏點。隨著上樣量的增加,樺褐孔菌三萜從開始就有少量泄漏,AB-8樹脂對總三萜的泄漏率呈增加趨勢;當上樣體積低于14 BV時,收集液濃度均在20 μg/mL以下并且增長緩慢;在14 BV后,泄露明顯;繼續上樣將產生更大的泄漏。所以選擇14 BV為最佳上樣量。
表1 大孔樹脂靜態吸附性能比較
圖1 大孔樹脂動態吸附泄漏曲線
由圖2可知,隨著上樣液質量濃度的提高,三萜類物質的吸附率不斷升高,當上樣液質量濃度為0.2 mg/mL時,吸附量達到最大,為7.666 mg/g。從理論上講,上樣液質量濃度越高,吸附率應該越高,因為質量濃度差越大越有利于擴散。但試驗前期研究樣品溶解度等綜合因素,發現樣品質量濃度不宜超過0.2 mg/mL。綜上,上樣液質量濃度選擇0.2 mg/mL。
圖2 上樣液質量濃度對三萜類化合物吸附量的影響
由圖3可知,當上樣流速為1.0,2.0和3.0 mL/min時,上樣終點(流出液質量濃度為上樣液質量濃度的1/10時)分別出現在15,3和2 BV附近。當上樣流速為2 mL/min時,上樣終點出現最早,原因是上柱流速過快會使傳質過程無法完全進行,從而引起泄露。如果流速較慢,有效成分被大孔樹脂充分接觸,吸附量增加,但吸附時間增加會造成生產過程過長。綜合考慮吸附效果和工作效率,最終選擇1 mL/min上樣流速。
圖3 不同上樣流速時的吸附效果
由圖4可知,隨著洗脫劑乙醇體積分數的增加,洗脫劑對樺褐孔菌三萜類化合物的解吸能力增大,表現為三萜類化合物的解吸率隨著乙醇體積分數的升高而增加。原因是乙醇體積分數越高,極性越小,而弱極性的AB-8樹脂與極性較小的三萜類化合物極性相似,越容易被洗脫下來,故三萜類化合物的解吸率隨著乙醇的體積分數升高而升高,但考慮到乙醇體積分數越大,不僅有效成分會洗脫出來,雜質也會被洗脫下來,故確定用60%乙醇除去雜質,再用90%乙醇富集三萜類成分。
圖4 不同體積分數乙醇的解吸效果
由圖5可知,以90%乙醇洗脫,質量濃度峰值出現在1~4 BV,其中洗脫液體積為2 BV時總三萜含量最高;18 BV后三萜質量濃度已經很小,只有23.32 μg/mL。18 BV時已流出總解吸液95.78%的三萜化合物。綜合考慮,18 BV為合理的洗脫劑用量。
圖5 AB-8樹脂動態解吸曲線
由圖6可知,以1.0 mL/min的速度洗脫時峰形較窄;而以2.0或3.0 mL/min的速度洗脫則峰形變寬。當洗脫流速為1 mL/min時,洗脫率最高,2.0 mL/min與3.0 mL/min的解吸量差異小,但二者均顯著低于1.0mL/min。綜合考慮洗脫率和洗脫效率,1.0 mL/min的洗脫流速較為合理。
圖6 不同解吸流速時的解吸曲線
樺褐孔菌三萜粗提物經AB-8大孔樹脂吸附、90%乙醇洗脫、水浴揮干至恒質量,得淡黃色粉末,即為樺褐孔菌三萜。純度可達85.13%,與純化前總三萜質量分數為28%,提高了2.04倍。說明上述純化工藝效果明顯,具有實際應用性。
此次試驗采用大孔樹脂對樺褐孔菌提取物中的總三萜進行純化,選擇AB-8大孔樹脂作為理想樹脂。經過以上考察,得到最佳分離純化工藝條件:上樣液質量濃度0.2 mg/mL,上樣流速1 mL/min,上樣體積14 BV,洗脫流速1 mL/min,最后用90%洗脫18 BV。在此條件下,三萜類化合物的純化率可達到85.13%。結果表明,利用大孔吸附樹脂可以對植物內的活性化合物實現高效富集,除去雜質化合物以提高有效成分的含量,大孔吸附樹脂分離富集樺褐孔菌三萜化合物技術的應用過程操作簡單且可擴大化生產。此次試驗可為更好地研究和應用這一藥用真菌、深入開發利用這一資源、擴大藥物的適用范圍、進一步研究發現其藥理活性物質奠定基礎。