金鯧魚骨中魚油的提取工藝及脂肪酸成分分析

于淑池 ，李晨晨，徐云升 ，薛長風 ，裴志勝

1. 海南熱帶海洋學院食品科學與工程學院（三亞 572022）；2. 海南省海洋食品工程技術研究中心（三亞 572022）；3. 海洋食品精深加工關鍵技術省部共建協同創新中心（三亞 572022）

金鯧魚（Trachinotus ovatus）系鱸形目，鲹科，學名卵形鯧鲹，地方名稱黃臘鯧、金鯧、黃臘鲹[1]，是海南、廣西、廣東和福建主要海水養殖品種之一[2]，2016年產量約15萬 t[3]，年產值將近100億元[4]，其體形較大，肉質細嫩，味道鮮美，無肌間刺，是加工魚塊的優良材料[5]；自2005年以來，金鯧魚的加工制品比例不斷升高，占總產量的50%～80%[6]。加工過程中有魚頭、魚骨、內臟等副產物產生，大多是直接丟棄，這不僅造成資源浪費，還污染環境[7]。實驗室前期從金鯧魚骨中提取明膠時發現[8]，金鯧魚骨（干質量）中粗脂肪含量非常高（43.75%±0.28%），目前從金鯧魚骨中提取魚油的報道鮮見，僅有曹璇等[9]利用超聲波輔助稀堿水解法提取了金鯧魚骨油，采用酶解法提取金鯧魚骨油還未見報道。因此，此次試驗采用環境友好的酶解法提取金鯧魚骨魚油，以實現對金鯧魚加工副產物的高值化利用，同時減少環境污染。

目前魚油提取方法主要有淡堿水解法、壓榨法、有機溶劑法、蒸煮法、低溫提油法、酶解法（水酶法）、酸水解法、超臨界流體萃取法等[10-11]；酶解法是利用蛋白酶水解破壞蛋白質和脂肪之間的結合釋放油脂[12]，具有作用溫和、時間短的特點，且有效保護油脂組分，能夠充分釋放原料中的油脂，從而提高魚油品質和魚油提取率[13]，蛋白酶水解生產的酶溶液可進一步加工，亦可以作為廢棄資源再利用；因此避免了加工過程中原料及副產物的浪費。

此次試驗以金鯧魚骨為原料進行提取并精煉魚油，首先通過單因素試驗篩選出最佳酶種類及酶解條件，再進一步通過正交試驗確定最佳酶解工藝，對提取的金鯧魚骨油進行理化指標測定及脂肪酸組成分析，為金鯧魚等水產品加工副產物的高值化利用提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

金鯧魚，市售。氫氧化鈉、鹽酸、乙醚、酚酞、碘化鉀、磷酸、冰乙酸、異辛烷，均為分析純，西隴科學股份有限公司；凹凸棒土、酵母粉、淀粉，均為食品級，廣東一品鮮生物科技有限公司；木瓜蛋白酶（50 000 U/g）、中性蛋白酶（20 000 U/g）、胰蛋白酶（10 000 U/g）、堿性蛋白酶（10 000 U/g），南寧龐博生物工程有限公司；胃蛋白酶（30 000 U/g），深圳恒生生物科技有限公司；風味蛋白酶（30 000 U/g），無錫市聯合恒洲化工有限公司；所有酶均為食品級；脂肪酸甲酯標準品，美國NuChek-Prep公司。

1.2 儀器與設備

HWS-26超級恒溫水浴槽，金壇市盛藍儀器有限公司；MultifugeX1R高速冷凍離心機，賽默飛世爾科技（中國）有限公司；LT-DBX23N（熱風循環）烘箱，北京普析通用儀器有限公司；FA2204B電子天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；GM200全新刀片式研磨儀，德國萊馳公司；PB-10酸度計，賽多利斯科學儀器有限公司；7890A氣相色譜儀，美國Agilent公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 金鯧魚骨魚油提取的工藝流程

金鯧魚預處理（去內臟及魚肉，去掉魚頭）→魚骨55 ℃烘箱烘干至恒質量→研磨儀（轉速10 000 r/min）打碎魚骨→過孔徑0.250 mm篩→魚骨粉→加入一定量水，調節料液比→加入NaOH/HCl調至各酶的最適pH→加酶升溫酶解→滅酶（沸水浴10 min）→離心（5 000 r/min離心10 min）→4 ℃冷藏5 h→倒出酶解液，得粗魚油→精煉→磷酸脫膠[14]→氫氧化鈉脫酸[14]→凹凸棒土脫色[15]→酵母粉脫腥[15]→計算魚油提取率→魚油品質評價

1.3.2 金鯧魚骨魚油酶解提取的最佳工藝確定

1) 最佳水解酶種類選擇。分別采用胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、胃蛋白酶、風味蛋白酶和堿性蛋白酶，在各種酶的最適條件（胰蛋白酶：pH 8.0，50 ℃。中性蛋白酶：pH 7.0，50 ℃。胃蛋白酶：pH 2.0，50 ℃[10]。木瓜蛋白酶：pH 7.0，50℃[16]。風味蛋白酶：pH 9.0，55 ℃。堿性蛋白酶：pH10.0，65 ℃[17]）下，添加相同的酶用量2.25×103U/g（以原料計），料液比1∶1（g/mL），酶解時間5 h，篩選出最適合的蛋白酶，以魚油提取率作為評價指標。魚油提取率按式（1）計算。

2) 金鯧魚骨魚油提取的單因素試驗方法。利用木瓜蛋白酶提取金鯧魚骨魚油，初步固定酶添加量2.25×103U/g、酶解pH 7.0、料液比1∶1（g/mL）、酶解溫度55 ℃、酶解時間5 h，分別展開酶添加量（0.75，1.5，2.25，3和3.75×103U/g）、酶解pH（5，5.5，6，6.5和7）、料液比（1∶0.5，1∶1，1∶1.5，1∶2和1∶2.5 g/mL）、酶解溫度（40，45，50，55和60 ℃）、酶解時間（3，4，5，6和7 h）5個因素的單因素試驗，每組試驗重復3次，結果取平均值，以魚油提取率作為評價指標，從而確定最優的單因素條件。

3) 金鯧魚骨魚油提取的正交試驗設計。根據單因素試驗結果，固定木瓜蛋白酶酶解pH 6.0，選擇酶添加量（A）、料液比（B）、酶解溫度（C）和酶解時間（D）4個因素，各取3個水平，以魚油提取率為評價指標，進行L9(34)正交試驗，因素水平見表1。

表1 正交試驗因素水平表

1.3.3 金鯧魚骨魚油理化指標測定方法

魚油的感官指標評價參照SC/T 3502—2016；過氧化值的測定參照GB 5009.227—2016；酸值的測定參照GB 5009.229—2016；碘價的測定參照GB/T 5532—2008；水分及揮發物的測定參照GB 5009.236—2016；不溶性雜質的測定參照 GB/T 15688—2008。

1.3.4 氣相色譜法分析脂肪酸成分

參照GB 5009.168—2016《食品中脂肪酸的測定》，采用GC法分析脂肪酸組成，首先利用堿法對樣品甲酯化，取適量樣品加入1.5 mL正己烷和40 μL乙酸甲酯，再加入100 μL甲醇鈉-甲醇（0.5 mol/L）溶液，在37 ℃下反應20 min，然后置于-20 ℃下冷凍10 min，取出后迅速加入60 μL草酸，離心取上清液，并將上清液通過無水硫酸鈉柱以除去其中的水分，氮氣吹干，加正己烷復溶，進行氣相色譜分析。

氣相色譜條件：FID檢測器，1 μL自動進樣；色譜柱采用熔融石英毛細管柱（100 m×0.25 mm×0.2 μm，CP-Sil88，Chrompack，Agilent，USA）。進樣口溫度為250 ℃。爐溫為程序升溫：45 ℃時保持4 min，然后以13 ℃/min的升溫速率將溫度升至215 ℃，保持35 min，總測定時間為86 min；檢測器的溫度為250 ℃，氫氣流速為30.0 mL/min；氮氣流速為30.0 mL/min。

1.4 數據處理

每個試驗重復3次，結果取平均值；單因素試驗及正交試驗數據采用Excel作圖，采用SPSS 17.0進行顯著性分析；脂肪酸的組成分析，采用Agilent Chemstation軟件對氣相色譜數據進行分析處理，通過與脂肪酸甲酯標準對照，采用面積百分比確定各種脂肪酸所占的百分含量（以峰面積的百分比表示）。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 蛋白酶種類對金鯧魚骨魚油提取率的影響

蛋白酶具有良好的破乳效果，可水解界面蛋白質，降低界面強度，破壞蛋白質和魚油的結合，促進油滴的聚結和絮凝[18]，釋放出油脂。采用木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶、胃蛋白酶、風味蛋白酶和堿性蛋白酶，在其各自最適溫度與pH條件下對金鯧魚骨進行酶解提油，魚油提取率結果見圖1。在加酶量相同的條件下，木瓜蛋白酶的提油率明顯高于其他5種蛋白酶，魚油提取率可達17.2%；風味蛋白酶、中性蛋白酶和堿性蛋白酶的提油率在10%左右，胰蛋白酶和胃蛋白酶的提油效果最差，絕大部分魚油未得到充分的釋放。可能是由于不同酶在蛋白質上的作用位點不同，蛋白水解程度也不同；李平等[17]利用5種蛋白酶提取三文魚魚皮油脂，也是木瓜蛋白酶酶解效果最好，與此次試驗結果一致，推測可能與木瓜蛋白酶的活性位點、酶解環境等有關，木瓜蛋白酶可以切開點羧基側任一氨基酸殘基的肽鍵[19]，水解效率很高；隨著木瓜蛋白酶的水解，與脂質相關的蛋白裂解程度高[20]，從而使魚油易于釋放。

圖1 不同種類蛋白酶對金鯧魚骨魚油的酶解提油效果比較

2.1.2 木瓜蛋白酶添加量對魚油提取率的影響

從圖2可以看出，隨著木瓜蛋白酶添加量的增加，魚油提取率呈現先增大后減小的趨勢。當木瓜蛋白酶添加量為1.5×103U/g時，提取率達到最大值（19.35%）。隨著酶量的繼續增加，提油率呈現出下降的趨勢，原因可能是釋放的脂質與肽或磷脂乳化，降低了油脂提取率[21]。Del Valle等[22]指出水解度過高會導致乳狀液形成，不利于脂質的釋放。因此木瓜蛋白酶的最適添加量為1.5×103U/g。

2.1.3 酶解pH對魚油提取率的影響

木瓜蛋白酶催化反應的pH范圍是3.5～9，最適pH一般為5～7，單因素水平設置以最適范圍按等差數列展開。從圖3可以看出，隨著pH增加，魚油提取率呈現先增大后稍下降并趨于平緩的趨勢；當pH為6.0時，提取率達到最大值（8.56%），因此木瓜蛋白酶的最適pH為6.0。

圖2 酶添加量對魚油提取率的影響

2.1.4 料液比對魚油提取率的影響

從圖4可以知道，料液比在1∶0.5～1∶1.5（g/mL）范圍內與酶解提油效果呈正比，水量增加越多，酶解效果越好，魚油提取率也越好，且在1∶1.5（g/mL）時達到最大值（19.48%）。原因可能是整個酶解系統內水分可以幫助蛋白酶與底物接觸充分，提高酶解速度，增加酶解程度，同時脂肪也易于溶出[23]。水量一旦超過限度，水分的增加致使底物濃度降低，造成酶解不完全和油脂提取率降低，因此最佳料液比為1∶1.5（g/mL）。

圖3 酶解pH對魚油提取率的影響

圖4 料液比對魚油提取率的影響

2.1.5 酶解溫度對魚油提取率的影響

木瓜蛋白酶催化反應的溫度范圍是20～80 ℃，最適溫度一般為50～60 ℃，單因素水平設置稍低于最適溫度按等差數列展開。由圖5可知，魚油提取率隨著溫度的上升呈現先增大后減小的趨勢，55 ℃時達到最大值（18.28%），隨后油脂提取率有逐漸下降，究其原因，蛋白酶生理活性在最適宜溫度時達到最高，過高的溫度會破壞酶的分子結構從而發生變性，失去活性，降低酶與底物的反應速度[15]。與此同時，溫度過高也會加快油脂的氧化導致品質降低。綜上所述，較適宜的酶解溫度為55 ℃。

圖5 酶解溫度對魚油提取率的影響

2.1.6 酶解時間對魚油提取率的影響

從圖6可以看出，金鯧魚骨魚油的提取率隨初期時間增加而升高，酶解4 h魚油提取率達到最高（21.44%）；酶解時間4 h后，油脂提取率增速趨于平衡，原因可能是隨著時間的增加，木瓜蛋白酶與底物充分接觸，作用狀態基本達到平衡。此外，隨著時間的延長，油脂顏色也逐漸加深，可能是部分多不飽和脂肪酸發生了氧化[24]。綜合考慮，最宜酶解時間為4 h。

圖6 酶解時間對魚油提取率的影響

2.2 正交試驗結果

由表2的極差R值分析可知，酶添加量（A）、料液比（B）、酶解溫度（C）和酶解時間（D）4個因素對提油率的影響主次效應為A＞C＞D＞B，即酶添加量對提油率影響最大，其次是酶解溫度，再次是酶解時間，料液比的影響最小。4種因素的最佳組合為A2B3C2D2，即酶添加量1.5×103U/g，料液比1∶1.75（g/mL），酶解溫度55 ℃，酶解時間4 h。經驗證，魚油提取率可達24.85%。

王海軍等[25]采用稀堿水解法提取鰱魚骨粗魚油，提取率為39.83%（折合成占魚骨的百分比為5.97%）；曹璇等[9]采用超聲波輔助稀堿水解法提取金鯧魚骨油，其提取率為80.51%（折合成占魚骨的百分比為24.12%）；白艷等[26]用胰蛋白酶提取鰻魚下腳料的魚油，提取率為23.87%；薛宇航等[27]采用胰蛋白酶和胃蛋白酶雙酶法提取星鰻骨魚油，提取率為24.44%。此次試驗結果遠遠高于鰱魚骨油的提取率，與超聲波輔助稀堿水解法提取金鯧魚骨油、酶解法提取鰻魚下腳料魚油以及雙酶水解星鰻魚骨油的提取率基本相當；而且此次試驗得到的是精煉魚油，顯示出木瓜蛋白酶酶解金鯧魚骨提油的良好效果和實際應用潛力。

表2 金鯧魚骨酶解提取魚油的正交試驗結果

2.3 金鯧魚骨油感官及理化指標的測定結果

依據SC/T 3502—2016，對最佳提取工藝條件下提取精煉的金鯧魚骨魚油進行感官評價，結果見表3。金鯧魚骨魚油色澤呈淡黃色，澄清透亮，稍有魚油特有的腥味，無酸敗味，感官指標符合SC/T 3502—2016精制油標準。表4為金鯧魚骨魚油相關理化指標測定結果。

表3 金鯧魚骨油感官指標

從表4可以看出，金鯧魚骨魚油相關理化指標分別為碘價141.36 g/100 g，過氧化值2.56 meq/kg，不溶性雜質含量0.08%，符合 SC/T 3502—2016精煉魚油的一級標準；酸值為1.13 mg/g，水分及揮發物含量為0.17%，符合 SC/T 3502—2016精煉魚油的二級標準。

表4 金鯧魚骨魚油理化特性

2.4 金鯧魚骨魚油脂肪酸成分分析

采用氣相色譜法，分析金鯧魚骨魚油肪酸組成，結果見表5。金鯧魚骨魚油主要由C12～C22脂肪酸組成，飽和脂肪酸有9種，相對百分含量為36.88%，其中以棕櫚酸為主。不飽和脂肪酸相對百分含量為63.05%，其中單不飽和脂肪酸有6種，相對百分含量為32.80%，主要由油酸組成；多不飽和脂肪酸有10種，相對百分含量為30.27%，其中亞油酸的含量最高，其次為α-亞麻酸、DHA，同時還含有少量的EPA、DPA。郭萌萌等[28]通過GC法分析金鯧魚魚骨主要脂肪酸組成，其飽和脂肪酸含量為32.82%，單不飽和脂肪酸含量為34.27%，多不飽和脂肪酸含量為31.84%；油酸含量為26.91%、亞油酸含量為21.88%；曹璇等[9]采用GC/MS對超聲波輔助稀堿水解法提取的金鯧魚骨油脂肪酸C7～C24成分分析發現，金鯧魚骨油中飽和脂肪酸含量為31.56%，不飽和脂肪酸含量為68.44%；其中單不飽和脂肪酸總量為37.99%，多不飽和脂肪酸總量為30.45%；其中油酸（27.86%）和棕櫚酸（21.46%）含量最高，富含亞油酸、二十二碳六烯酸和二十碳五烯酸。此次試驗與已報道的金鯧魚骨油脂肪酸測定結果基本一致。

表5 金鯧魚骨魚油脂肪酸組成及含量

3 結論

此次試驗以金鯧魚骨為原料，通過單因素試驗及正交試驗，最終得到金鯧魚骨魚油酶解提取的最佳工藝參數：木瓜蛋白酶為最佳水解酶，在pH 6.0條件下，添加量1.5×103U/g，料液比1∶1.75（g/mL），酶解溫度55 ℃，酶解時間4 h，最佳工藝條件下的提取率為24.85%；采用木瓜蛋白酶酶解魚骨提取魚油提取條件溫和，魚油質量好、純度高。所得魚油色澤呈淡黃色，澄清透亮，具有魚油特有的微腥味，無酸敗味，感官指標符合SC/T 3502—2016精制魚油的標準；碘價、過氧化值、不溶性雜質3項指標符合SC/T3502—2016的一級標準；酸值、水分及揮發物指標符合SC/T 3502—2016的二級標準；氣相色譜分析表明，酶解法提取的金鯧魚骨魚油以棕櫚酸、油酸、亞油酸含量最高，不飽和脂肪酸含量（63.05%）遠高于飽和脂肪酸含量（36.88%），其中單不飽和脂肪酸、多不飽和脂肪酸含量分別為32.80%和30.27%，亞麻酸和DHA含量較高，表明金鯧魚骨油是一種較高品質的油脂。此次試驗可以為綜合利用金鯧魚加工副產物提供參考。