雙酶法提取玫瑰花多酚黃酮及其提取液抗氧化性分析

狄飛達，鄭亭，紀芯鑰，劉一靜，涂彩虹，張馳松

1. 成都市農林科學院，農產品加工與貯藏研究所（成都 611130）；2. 四川農業大學農學院（成都 611130）；3. 四川旅游學院（成都 610110）

玫瑰（Rosa rugosa）作為我國一種悠久文化的美食原料，不僅有觀賞價值，還具有營養保健價值。玫瑰花中含有大量維生素、氨基酸、多酚黃酮、可溶性糖、生物堿、礦物質等營養物質，具有極強的抗氧化能力[1]，2010年國家衛生部頒布相關法規將其納為食品，成為藥食兩用的食品之一。Zheng等[2]對中國常見的65種可食用花卉研究發現，玫瑰花的多酚黃酮及抗氧化活性均為第一，肖麗宏等[3]發現云南墨紅玫瑰色素粗提物對人結腸癌細胞活性有較強抑制能力，具有較好體外抗氧化活性。因此，玫瑰花在食品工業中具有廣泛應用前景。

然而，玫瑰花產品開發主要集中在玫瑰花茶[4]、玫瑰花酒[5]、玫瑰果醬[6]等；針對玫瑰花多酚黃酮的優化試驗多以醇溶液為研究對象[7]，雖然提取率較高，但實際生產成本也較高，不利于后期食品加工直接使用。生物酶解技術具有提高果蔬汁澄清度和提取率的優點，并且反應體系溫和，應用范圍較為廣泛[8]。因此，以新鮮墨紅玫瑰花為原料，探討復合酶種類、酶活比及料水比對提取玫瑰多酚黃酮含量的影響，在此基礎上通過單因素試驗和正交試驗考察雙酶活添加量、酶解溫度、pH、酶解時間等因素對玫瑰花多酚黃酮的影響并評價其抗氧化活性，為玫瑰花實際生產提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玫瑰花（云南紅河產地，品種為墨紅，要求完整、無蟲蛀、無霉變、無腐爛采后立即于10 ℃下預冷2 h，放入-30 ℃冰箱中速凍，貯藏在-20 ℃冰箱）；果膠酶、纖維素酶、木聚糖酶（食品級，南寧龐博生物工程有限公司）；檸檬酸、碳酸氫鈉（食品級，山東福田藥業有限公司）；1, 1-二苯基-2-苦肼基（DPPH·）、羥自由基（·OH）（索萊寶公司）。

1.2 儀器與設備

恒溫水浴鍋（HH-S，天津賽得利斯實驗分析儀器制造廠）；低速離心機（D5B，上海盧湘儀離心機儀器有限公司）；無油隔膜真空泵（HP-01，上海力辰邦西儀器科技有限公司）；打漿機（HR3868，荷蘭皇家飛利浦公司）；pH計（CT-6023，北京華運安特科技有限責任公司）；電子天平（AUY220，SHIMADZU（島津）公司）；手持色差儀（CR-400，柯尼卡美能達控股公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 玫瑰花提取液工藝流程

1.3.1.1 工藝流程

預處理→護色預榨汁→保溫調節pH→加入復合酶酶解→滅酶離心→抽濾成品

1.3.1.2 操作要點

預處理：將玫瑰花放置于4 ℃冰箱解凍5 min，清洗瀝干。

護色預榨汁：將解凍的玫瑰花與4 ℃冰水按照一定料水比配制，加入0.05%蘋果酸、0.05%檸檬酸進行護色打漿8 s[9]。

保溫調節pH：將打漿后的玫瑰汁保溫，并調節適當pH。

加入雙酶酶解：添加一定量雙酶，并放入振蕩培養箱酶解。

滅酶離心：將反應好的玫瑰花提取液95 ℃滅菌10 min，并在4 000 r/min條件下離心15 min。

抽濾成品：將離心后的上清液抽濾過0.45 μm濾膜得到澄清的玫瑰花提取液。

1.3.2 雙酶活比例的確定

稱取10.0 g玫瑰花，在料水比1∶20（g/mL）、酶解溫度45 ℃、pH 3.5、酶活添加量800 U/g條件下酶解180 min，研究不同單一酶（果膠酶、木聚糖酶、纖維素酶）及不同雙酶活比對玫瑰花多酚黃酮含量的影響。

1.3.3 料水比的選擇

在m（果膠酶）∶m（木聚糖酶）=1∶2條件下，其他條件同1.3.2，考察不同料水比（1∶10，1∶15，1∶20，1∶25和1∶30（g/mL））對玫瑰花多酚黃酮含量的影響。

1.3.4 單因素試驗

稱取10.0 g玫瑰花，在料水比1∶20（g/mL）、雙酶為m（果膠酶）∶m（木聚糖酶）=1∶2條件下，考察雙酶活添加量（200，400，600，800，1 000，1 200和1 400 U/g），酶解溫度（30，35，40，45，50，55和60 ℃），酶解時間（30，60，90，120，150，180和210 min），pH（2.0，2.5，3.0，3.5，4.0，4.5和5.0）4個因素對玫瑰花多酚黃酮含量的影響。

1.3.5 正交試驗設計

在單因素試驗基礎上，選擇雙酶活添加量（A）、酶解溫度（B）、酶解pH（C）、酶解時間（D）為自變量，設計4因素3水平的正交優化試驗，以提高酶解玫瑰花提取液多酚黃酮含量。試驗設計見表1。

表1 正交試驗因素與水平設計

1.4 試驗測定方法

1.4.1 多酚測定方法

參考GB/T 8313—2018《茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測方法》[10]及文獻[11]，略有修改，采用Folin-Ciocalteu比色法測定玫瑰花及花汁多酚含量。以沒食子酸為標準品，取質量濃度0.008～0.040 mg/mL沒食子酸各1 mL，加入5 mL 10%福林酚試劑，反應8 min后加入4 mL 7.5%碳酸鈉溶液，室溫下避光放置60 min后于765 nm波長條件下用分光光度計測定吸光度，以蒸餾水代替標液為空白對照繪制標曲，得到沒食子酸質量濃度y（mg/mL）與吸光度x的回歸方程為y=11.037x-0.001 5（R2=0.999 2）計算玫瑰花提取液中的多酚含量，結果以沒食子酸當量（GAE）表示，單位為mg/mL。測定玫瑰花提取液時，取1 mL玫瑰花澄清汁定容到100 mL，搖勻按照上述方法測定。玫瑰花提取液中的總酚含量以每克玫瑰花中所含的總酚（mg/g，以GAE計）含量計。

1.4.2 黃酮測定方法

參考文獻[12]，略有修改，采用NaNO2-Al(NO3)3分光光度計法測定玫瑰花及花汁的總黃酮含量。配置0.2 mg/mL蘆丁標準溶液，吸取0，0.25，0.50，1.00，2.00，3.00，4.00和6.00 mL蘆丁標準溶液置于25 mL比色管，用60%乙醇補充至15 mL，加入1 mL 5%亞硝酸鈉溶液搖勻后放置反應6 min，加入1.5 mL 10%硝酸鋁溶液搖勻放置6 min，加入4 mL 10%氫氧化鈉溶液，并用60%乙醇定容到25 mL，搖勻反應15 min后在波長510 nm處測定吸光度，吸光度，以蒸餾水代替樣品溶液做空白對照，得到蘆丁質量濃度y（mg/mL）與吸光度A的回歸方程為y=0.011 3x+0.001 3（R2=0.999 4）算樣品中的總黃酮含量，結果以蘆丁當量（RE）表示，單位為mg/mL。測定玫瑰花提取液時，取10 mL玫瑰花澄清汁定容到100 mL，搖勻按照上述方法測定，玫瑰花提取液中的總黃酮含量以每克玫瑰花中所含的黃酮（mg/g，以RE計）含量計。

1.4.3 色差值測定方法

通過手持色差儀，從L*、a*、b*驗證判斷最優玫瑰澄清汁成色效果。采用食品工業中常用的國際照明委員會（CIE）推薦的L*、a*、b*。L*值表示亮度，又稱白度值（白～黑），L*越大亮度越大；a*值又稱紅度值，表示有色物質的紅綠偏向，正值越大偏向紅色的程度越大，負值絕對值越大偏向綠色的程度越大；b*值又稱為黃度值，表示有色物質的黃藍偏向，正值越大偏向黃色的程度越大，負值絕對值越大偏向藍色的程度越大。

1.4.4 玫瑰花提取液抗氧化活性測定方法1.4.4.1 DPPH·清除率的測定

參考文獻[13]，略有改動，配制0.5～50 mg GAE/g濃度提取液，準確移取待測樣品液1.0 mL于試管中，加入1.0 mL 0.1 mmol/L DPPH溶液。以2.0 mL蒸餾水作為空白、1.0 mL DPPH溶液與1 mL蒸餾水混合液作為對照，振搖混勻后進行避光保存30 min，在517 nm處測定吸光度。DPPH·清除率按式（1）計算。

式中：A為樣品吸光度；A0為對照組吸光度。

1.4.4.2 ·OH清除率的測定

參考文獻[3]，略有改動，配制0.5～50 mg GAE/g濃度提取液，準確移取待測樣品液1.0 mL于試管中，依次加入1.0 mL 0.15 mol/L硫酸亞鐵溶液、2 mmol/L水楊酸-乙醇溶液，加入1 mL 6 mmol/L過氧化氫溶液，振搖混勻放入37 ℃水浴鍋中水浴30 min，放置冷卻后在510 nm處測定樣品的吸光度。用蒸餾水對H2O2和樣品進行替換，510 nm波長處測定相應的吸光度。·OH清除率按式（2）計算。

式中：A1為樣品吸光度；A2為用蒸餾水替換H2O2后測得對應吸光度；A0為蒸餾水替換樣品后測的吸光度。

1.5 數據處理

每組試驗均重復3次，采用Excel進行數據記錄，Origin 9.0進行數據分析，SPSS進行Duncan（p＜0.05）法比較分析。

2 結果與分析

2.1 玫瑰花多酚黃酮含量

試驗采用的玫瑰花是云南墨紅玫瑰品種，含水量82.5%±1.1%，多酚含量70.2±1.4 GAE mg/g（以鮮重計算），總黃酮含量35.1±2.3 RE mg/g（以鮮重計算），與Zheng等[2]研究數據較為一致。

2.2 單一酶解種類、雙酶活比例的確定

酶解技術具有提高果蔬汁澄清度、活性成分等優點，被廣泛應用于果蔬加工，其中比較常用的有果膠酶、纖維素酶、木聚糖酶等[14]。不同酶制劑對玫瑰花多酚黃酮含量的影響如圖1所示。果膠酶、木聚糖酶均能顯著提高玫瑰花提取液的多酚和總黃酮含量，分別達到43.65 mg/g，21.70 mg/g和40.22 mg/g，21.93 mg/g。

圖1 單一酶種類對玫瑰花提取液多酚黃酮含量的影響

在實際生產中，為進一步提高果蔬汁產品質量，常采用復合酶制劑處理果蔬汁[15]，在單一酶制劑試驗基礎上，發現果膠酶、木聚糖酶不同酶活比對于玫瑰花提取液多酚黃酮的含量均有一定影響，由圖2可知，酶活比（m（果膠酶）∶m（木聚糖酶））=1∶2時玫瑰花提取液多酚黃酮含量最高，此處理下，多酚和總黃酮含量相比于未經酶處理均提高約25%，結合圖1分析可知，相比于單一酶處理提高約15%。故選擇最佳雙酶活比例1∶2。

2.3 料水比的選擇

酶解反應中，料水比大小會影響酶與底物接觸程度及溶質的擴散速率[16]，不同料液比對玫瑰花提取液多酚黃酮含量的影響如圖3所示。料水比1∶20（g/mL）時，玫瑰花提取液多酚黃酮含量最高，分別為48.84和21.84 mg/g。因此選擇最佳料水比1∶20（g/mL）。

圖2 雙酶比例對玫瑰花提取液多酚黃酮含量的影響

圖3 料水比對玫瑰花提取液多酚黃酮含量的影響

2.4 單因素對玫瑰花提取液玫瑰花提取液多酚黃酮含量的影響

2.4.1 雙酶活添加量對玫瑰花提取液玫瑰花提取液多酚黃酮含量的影響

復合酶活在一定條件下添加量越多，細胞壁降解程度越大，活性成分溶出也會越多[17]。由圖4可知，隨著雙酶活添加量增加，玫瑰花提取液多酚黃酮含量逐漸增加，添加量800 U/g時達到最高。因此選擇最佳雙酶活添加量800 U/g。

圖4 雙酶活添加量對玫瑰花提取液多酚黃酮含量的影響

2.4.2 酶解溫度對玫瑰花提取液多酚黃酮含量的影響

酶解反應中，不同的酶制劑具有不同的最適酶活反應溫度，并且溫度也會影響底物擴散，設置不同酶解溫度進行測試，以確定最佳酶解溫度。由圖5可知，酶解溫度為30～45 ℃時，玫瑰花提取液多酚黃酮含量逐漸升高，此后隨著溫度升高，含量逐漸降低，這是由于反應溫度過高會破壞酶結構，并且溫度過高會導致多酚降解[18]。因此選擇最適酶解溫度45 ℃。

圖5 酶解溫度對玫瑰花提取液多酚黃酮含量的影響

2.4.3 酶解pH對玫瑰花提取液多酚黃酮含量的影響

不同pH環境下，酶所表現的活力不一樣，酶解率也不同。由圖6可知，隨著pH增大，多酚含量逐漸增加，且在pH 3.5時增加幅度最大，隨后緩慢增加；黃酮含量在pH 3.5時達到最高值。此外，pH＞3.5時，玫瑰花提取液顏色偏橙黃色，這是由于玫瑰花色苷可能存在4種結構形式：醌式結構（藍色）、2-苯基苯并吡喃陽離子（紅色）、醇型假堿（無色）和查爾酮結構（無色），在pH 4～5時，溶液可能是有較多無色的醇型假堿和查爾酮結構存在，導致提取液顏色由紅色向橙黃色轉變[19]。因此，綜合色澤考慮，選擇最佳酶解pH 3.5。

圖6 酶解pH對玫瑰花提取液多酚黃酮含量的影響

2.4.4 酶解時間對玫瑰花提取液多酚黃酮含量的影響

由圖7可知，隨著酶解時間延長，玫瑰花提取液多酚黃酮含量逐漸增加，但超過180 min時，延長時間對多酚含量提升效果不顯著，這是由于隨著酶解時間增加，細胞壁破壞程度越高，達到臨界值以后，其細胞內溶出物趨于最大化，因此綜合考慮生產效率，酶解時間選用180 min。

圖7 酶解時間對玫瑰花提取液多酚黃酮含量的影響

2.5 正交試驗優化結果與分析

在單因素試驗的基礎上，進行L9(34)正交試驗后結果如表2所示。結果表明，各因素對于多酚含量的影響順序為A＞D＞B＞C，即雙酶活添加量＞酶解時間＞酶解溫度＞酶解pH；各因素對黃酮含量的影響順序為A＞C＞D＞B，即雙酶活添加量＞酶解pH＞酶解溫度＞酶解時間。分析得出，酶解提取多酚最優工藝為A2B1C3D3，酶解提取黃酮最優工藝為A2B1C2D3，而A2B1C3D3并未出現在試驗組合中，故對該組合進行驗證。

表2 正交試驗結果

2.6 正交驗證試驗及抗氧化活性分析

對正交試驗確定的兩組最佳提取工藝條件進行驗證試驗，并與未進行酶解處理的玫瑰花提取液進行對比，玫瑰花提取液的多酚黃酮含量、色差、抗氧化活性結果見表3。

由表3可知，A2B1C2D3與A2B1C3D3處理后的玫瑰澄清汁多酚黃酮含量相近，其并均優于未酶解處理的玫瑰花提取液，提高約50%。通過色差感官表明，A2B1C3D3組合a*值低于A2B1C2D3組合，此時，玫瑰澄清汁前者偏橙黃色，而后者呈現橙紅色，具有更好的感官品質，該組合玫瑰花提取液的DPPH·及·OH清除率顯著高于未酶解處理玫瑰花提取液，分別達到93.21%及84.31%。故而試驗最優組合為A2B1C2D3，即雙酶活添加量800 U/g，酶解溫度40 ℃，酶解pH 3.5，酶解時間210 min。

表3 優化后玫瑰花提取液多酚黃酮、色差及抗氧化活性結果

2.7 玫瑰花提取液體外抗氧化活性分析

由圖8可知，在0.5～50 mg GAE/g濃度范圍內，玫瑰花提取物對DPPH·清除能力與其濃度呈正相關關系，玫瑰花提取物濃度大于10 mg GAE/g后，其對DPPH·清除能力緩慢上升。根據IC50值可以確定清除自由基能力的強弱[20]，試驗中，玫瑰花提取物清除DPPH·的IC50約1 mg GAE/g。

由圖9可知，在0.5～50 mg GAE/g濃度范圍內，玫瑰花提取物對·OH清除能力與其濃度呈正相關關系。根據數據可知，玫瑰花提取物清除·OH的IC50約1.5 mg GAE/g。

圖8 玫瑰花提取物濃度對DPPH·清除率的影響

圖9 玫瑰花提取物濃度對·OH清除率的影響

3 結論

試驗確定雙酶法酶制備富含多酚總黃酮玫瑰花提取液的最佳工藝：雙酶活添加量（m（果膠酶）∶m（木聚糖酶）=1∶2）800 U/g，酶解溫度40 ℃，酶解pH 3.5，酶解時間210 min，按照此工藝制得的玫瑰花提取液多酚含量為53.15 mg/g（以GAE計），總黃酮含量為28.32 mg/g（以RE計），相對于未酶解處理提高約50%。具有玫瑰典型的柔紅色澤，玫瑰花提取液的DPPH·及·OH清除率分別達到93.21%及84.31%，并且通過對不同濃度的玫瑰提取液研究表明，其提取液具有良好抗氧化活性。因此，采用雙酶法工藝制備富含多酚黃酮的玫瑰花提取液可行穩定，可作為玫瑰花液態健康食品的生產原料，對于玫瑰花的綜合利用提供思路。