魚蛋白水解產物抗氧化活性

胡二坤，郭興鳳，鄭慧

1. 河南職業技術學院烹飪食品與健康學院（鄭州 450046）；2. 河南工業大學糧油食品學院（鄭州 450001）

人體的新陳代謝會產生很多自由基，這些自由基會破壞生物分子的結構，改變其功能性質，最終導致細胞或組織損傷[1-2]。近年來，對天然活性物質的抗氧化能力的研究越來越多。天然活性物質的抗氧化活性評價的方法有很多，不同的方法有其特色和應用范圍。目前，關于天然活性物質抗氧化能力的評價方法主要有DPPH·清除率、超氧陰離子（O2-·）自由基清除率、羥自由基（·OH）清除率、還原力、抑制脂質過氧化的能力等。

以魚蛋白水解產物和3個分離組分作為研究對象，分別以DPPH·清除率、羥自由基（·OH）清除率和還原力為指標，評價魚蛋白酶水解產物及3個分離組分的抗氧化活性。通過多指標的評價，系統地研究魚蛋白水解產物的抗氧化活性。

1 材料與設備

1.1 材料與試劑

魚蛋白水解產物和分離產物：實驗室自制。采用堿性蛋白酶（酶活3.0×105U/mL），在底物濃度18.05%、加酶量2.40%、水解pH 8.07、水解溫度48.84℃條件下進行酶水解，酶解液經真空濃縮、冷凍干燥后制成粉末，即為魚蛋白水解產物。選用G-15葡聚糖凝膠作為柱材料分離純化魚蛋白水解產物，在上樣質量濃度100 mg/mL、上樣體積2 mL、蒸餾水洗脫、洗脫速度2.0 mL/min的條件下分離純化魚蛋白水解產物，得到3個分離組分：組分Ⅰ、組分Ⅱ和組分Ⅲ，3個分離組分的蛋白含量依次為83.70%，49.20%和36.91%，峰面積分別占51.70%，13.90%和34.40%。

DPPH（1, 1-二苯基-2-三硝基苯肼）：梯希愛（上海）化成工業發展有限公司。

水楊酸、乙醇、三氯乙酸、氯化鐵、鐵氰化鉀、硫酸亞鐵、鹽酸、抗壞血酸、過氧化氫、鄰苯三酚、三羥甲基氨基甲烷、茚三酮等試劑均為分析純。

1.2 試驗儀器與設備

RE-2000A旋轉蒸發器，上海亞榮生化儀器廠；LGJ-18型冷凍干燥機，北京四環科學儀器廠；AY120型分析天平，日本島津公司；722S可見分光光度計，上海精密科學儀器有限公司；TU-1810紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限公司；SHA-C型數顯水浴恒溫振蕩器，金壇華峰儀器有限公司；SL型恒溫水浴鍋，上海樹立儀器儀表有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 DPPH·清除率的測定

參照Jamdar等[3]的方法并稍作修改。取2 mL水解液，加入2 mL新配制的濃度1×10-4mol/L的DPPH溶液，搖勻，室溫避光條件下反應30 min，在517 nm處測定吸光度。空白試樣為不加入樣品或DPPH溶液，分別用等體積無水乙醇代替。清除率按式（1）計算。

式中：Al為樣品組加入樣品和DPPH溶液時的吸光度；A2為空白組加入樣品，不加入DPPH溶液時的吸光度；A3為對照組不加樣品，加入DPPH溶液時的吸光度。

1.3.2 還原力的測定

還原力的測定參照Oyaizu[4]的方法并適當修改，以普魯士藍的生成量為指標，將鐵氰化鉀還原為Fe2+，再利用Fe2+形成普魯士藍，在700 nm下測定普魯士藍的生成量。取2 mL魚蛋白粉水解液，加入2.5 mL 0.2 mol/L pH 6.6磷酸鹽緩沖液和2.5 mL 1%鐵氰化鉀后，在50 ℃條件下水浴反應20 min，取出，迅速冷卻并加入2.5 mL 10%三氯乙酸終止反應。取2.5 mL上述混合液，加入2.5 mL蒸餾水和0.5 mL 0.1%三氯化鐵，充分混合后靜置10 min，在700 nm下測定吸光度，同時以蒸餾水代替樣品做空白試驗。

1.3.3 羥自由基（·OH）清除率的測定

羥自由基清除率的測定方法基于水楊酸可以捕獲羥自由基（·OH）生成2, 3-二羥基苯甲酸和2, 5-二羥基苯甲酸，在510 nm處有最大吸收建立的一種用分光光度計檢測Fenton反應產生羥自由基的方法[5]。羥自由基（·OH）清除率的測定方法參照董銀萍等[6]的方法并做適合修改。取2 mL魚蛋白粉水解液，加入3 mL 1.8 mmol/L水楊酸-乙醇溶液，4 mL 1.8 mmol/L的FeSO4，最后加入0.2 mL 0.2% H2O2溶液啟動反應，在37 ℃水浴條件下反應30 min，在510 nm波長下測吸光度，同時做空白試驗。·OH清除率按式（2）計算。

式中：A為樣品組加入魚蛋白粉水解液測得的吸光度；A0為空白組用蒸餾水代替魚蛋白粉水解液測得的吸光度。

1.3.4 數據處理

試驗采用GraphPad、Origin 8.5、SPSS 16.0等軟件對所得相關數據進行統計分析。所有試驗至少重復三次，結果取三次試驗的平均值。

2 結果與討論

2.1 魚蛋白水解產物及分離組分的DPPH·清除能力研究試驗結果

由圖1可以看出，魚蛋白水解產物和3個分離組分的DPPH·清除能力均隨著濃度的增大而增強。從圖1（a）中可以看出，在1.0～7.5 mg/mL時，隨著魚蛋白水解產物濃度的增加，其DPPH·清除率呈現顯著性增加（p＜0.05），當魚蛋白水解產物質量濃度為2 mg/mL時，DPPH·清除率達到47.0%。由圖1（b）可見，組分Ⅰ在質量濃度為0.8～5.0 mg/mL時，其DPPH·清除率呈現顯著性增加，質量濃度為1.6 mg/mL時，組分Ⅰ的DPPH·清除率為51.1%。組分Ⅱ的DPPH·清除能力由圖1（c）所示，在0.5～8.0 mg/mL質量濃度范圍內，組分Ⅱ的DPPH·清除率顯著性增強，當質量濃度為2.0 mg/mL時，組分Ⅱ的DPPH·清除率為33.6%。組分Ⅲ的DPPH·清除率在0.4～4.0 mg/mL質量濃度范圍內顯著增加，當組分Ⅲ質量濃度為2.0 mg/mL時，其DPPH·清除率59.7%。

圖1 魚蛋白水解產物及分離組分質量濃度對DPPH·清除能力的影響

2.2 魚蛋白水解產物及分離組分還原能力研究試驗結果

由圖2可以看出，魚蛋白水解產物和3個分離組分的還原能力均隨著濃度的增加呈顯著性增加。由圖2（a）可見，魚蛋白水解產物在0.7～7.8 mg/mL濃度范圍內，還原力呈現顯著性增加，當魚蛋白水解產物質量濃度為4.3 mg/mL時，其還原力為0.450。圖2（b）為組分Ⅰ的還原能力隨濃度的變化趨勢，可以看出，在0.8～12.6 mg/mL質量濃度范圍內，還原力呈現顯著性增加，當組分Ⅰ質量濃度為6.7 mg/mL時，其還原力為0.442。圖2（c）為組分Ⅱ的還原能力曲線圖，在1.0～14.8 mg/mL時，組分Ⅱ的還原力隨著質量濃度的增大顯著性增加，當質量度濃度7.9 mg/mL時，其還原力為0.439。由圖2（d）可見，隨著組分Ⅲ在0.4～3.7mg/mL質量濃度范圍內增加，還原力呈現顯著性增加，當組分Ⅲ質量濃度為1.9 mg/mL時，其還原力為0.441。

圖2 魚蛋白水解產物及分離組分質量濃度對還原力的影響

2.3 魚蛋白水解產物及分離組分·OH清除能力試驗結果

由圖3可以看出，魚蛋白水解產物和3個分離組分的·OH清除能力均隨著濃度的增加呈現顯著性增加。由圖3（a）可見，魚蛋白水解產物在0.4～2.0 mg/mL濃度范圍內，·OH清除能力呈現顯著性增加，當魚蛋白水解產物質量濃度為0.7 mg/mL時，其·OH清除率為56.3%。圖3（b）為組分Ⅰ的·OH清除能力隨濃度的變化趨勢，可以看出，在0.8～8.4 mg/mL濃度范圍內，·OH清除能力呈現顯著性增加，當組分Ⅰ質量濃度為4.2 mg/mL時，其·OH清除能力為81.4%。圖3（c）為組分Ⅱ的·OH清除能力曲線圖，在0.01～2.00 mg/mL時，組分Ⅱ的·OH清除能力隨著濃度的增大顯著性增加，當質量濃度為0.3 mg/mL時，其·OH清除能力為67.0%。由圖3（d）可見，隨著組分Ⅲ在0.4～3.7 mg/mL質量濃度范圍內增加，·OH清除能力呈現顯著性增加，當組分Ⅲ質量濃度為1.5 mg/mL時，其·OH清除能力為69.4%。

圖3 魚蛋白水解產物及分離組分質量濃度對·OH清除能力的影響

2.4 魚蛋白酶水解產物及其分離純化組分IC50值比較研究試驗結果

分別對魚蛋白水解產物及分離組分Ⅰ、組分Ⅱ和組分Ⅲ進行IC50的測定，結果見表1。

由表1分析出，魚蛋白水解產物經過分離純化，部分組分的抗氧化能力得到提高。其中組分Ⅰ的DPPH·清除能力得到提高，組分Ⅱ的·OH清除能力得到提高，組分Ⅲ的DPPH·清除能力和還原能力都得到了提高。組分Ⅲ的DPPH·清除能力和還原能力最強，其DPPH·清除能力的IC50值為1.43 mg/mL；還原力在吸光度為0.5時，質量濃度為1.88 mg/mL。組分Ⅱ的·OH清除能力最強，IC50值為0.30 mg/mL。

表1 水解產物和分離組分的抗氧化能力測定結果單位：mg/mL

由于Fenton反應生成·OH需要亞鐵離子的參與，魚蛋白和3個分離組分對·OH的清除作用可能是由于一方面酶解物與亞鐵離子結合，抑制了自由基的產生；另一方面是對已產生的羥自由基清除[7]。魚蛋白水解產物對DPPH·清除作用是由于其可以向DPPH·提供電子或氫供體的疏水氨基酸暴露，使得魚蛋白水解產物具有清除DPPH·的能力[7]。魚蛋白水解產物提供電子或氫原子給自由基后，自身成為自由基中間體，中間體達到穩定態的時間和穩定態的穩定程度直接影響最終的自由基清除能力。因此，可以認為魚蛋白酶解物中小分子的肽段對清除自由基起了關鍵作用，這與莊永亮等[8]、Ko等[9]的結果一致。

3 結論

魚蛋白水解產物經過分離純化后，部分組分的抗氧化能力發生了變化。其中組分Ⅰ和組分Ⅲ的DPPH·清除能力、組分Ⅱ的·OH清除能力和組分Ⅲ的還原能力均增強。研究發現，3個組分中，組分Ⅲ的DPPH·清除能力和還原能力最強，其DPPH·清除能力的IC50值為1.43 mg/mL；還原力在吸光度為0.5時，質量濃度為1.88 mg/mL。組分Ⅱ的·OH清除能力最強，IC50值為0.30 mg/mL。