單酶法酶解核桃蛋白的影響因素

劉猛 ，樊鳳嬌，劉新民，趙輝

1. 呂梁學(xué)院生命科學(xué)系（呂梁 033000）；2. 山西省特色植物功能成分工程研究中心（呂梁 033000）；3. 南京財(cái)經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院（南京 210023）

核桃也稱為山核桃和胡桃，是一種醫(yī)藥與食用價(jià)值較高的油作物[1]，食用核桃可降低膽固醇吸收、降低心血管疾病的發(fā)病率等[2-6]。經(jīng)研究，核桃蛋白中含有生物活性肽成分，具有吸收快、消耗低、數(shù)量多的特點(diǎn)[7-11]。因此開發(fā)核桃資源、研究核桃蛋白功能特性極為重要[12]。

易建華等[13]用蛋白酶水解核桃蛋白，得出復(fù)合酶對(duì)核桃蛋白作用明顯。姜莉等[14]采用胰蛋白酶酶解核桃蛋白，提取核桃中的多肽。崔莉等[15]研究溫度對(duì)核桃蛋白的影響，得出核桃蛋白具有熱敏性，其最適宜變性溫度為67.05 ℃，相比植物蛋白變性溫度較低。核桃蛋白在稀堿溶液中溶解性較好，且不溶于水，其等電點(diǎn)在pH 5左右，隨著溫度的升高，其溶解度增大，當(dāng)溫度為55 ℃時(shí)，其溶解度達(dá)到最大。在略低于變性溫度，蛋白質(zhì)的乳化能力及乳化穩(wěn)定性增加時(shí)，溫度也隨著升高[16]。齊西婷等[17]利用水劑法酶解中性蛋白酶中的核桃粗蛋白，以VC為對(duì)照進(jìn)行試驗(yàn)，分析核桃粗蛋白水解產(chǎn)物的體外抗氧化性。毛曉英[18]在核桃脫脂粉的溶解性分析中表明，核桃蛋白溶液中的溶解度較之于乙醇溶液中的溶解度略高。

試驗(yàn)采用堿溶酸沉法提取核桃粕分離蛋白，通過單因素試驗(yàn)研究酶解溫度、pH、酶解時(shí)間和酶添加量對(duì)核桃蛋白水解度的影響，采用正交試驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化，得到堿性蛋白酶水解核桃蛋白的最佳水解條件。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

核桃粕（山西圣府第油脂有限公司）；堿性蛋白酶（北京奧博興生物技術(shù)有限公司）；鹽酸（福州飛凈生物科技有限公司）；甲醛溶液（天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司）；氫氧化鈉（河南愛典化工有限公司）；PBS磷酸鹽緩沖液（杭州永星五交化有限公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

PHBJ-260便攜式pH計(jì)（上海儀電科學(xué)儀器有限公司）；HH-6恒溫水浴鍋（國(guó)華電器有限公司）；TDL-40B高速離心機(jī)（湖南湘儀儀器開發(fā)有限公司）；JD200-3電子天平（賽多利科學(xué)儀器有限公司）；85-1恒溫磁力攪拌器（金壇市普瑞斯機(jī)械有限公司）；H29527超聲提取器（北京恒奧德儀器有限公司）；EPOCH2型酶標(biāo)儀（北京瑞利分析儀器有限公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 核桃蛋白的制備[19]

稱取100 g核桃粕于2 000 mL燒杯中，加2 000 mL蒸餾水，混勻，用1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至9.0，混勻，于50 ℃超聲提取（超聲功率250 W）1 h，靜置30min，以3 000 r/min離心20 min，上清液用1 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH至4.5，攪拌，靜置30 min，以3 000 r/min離心20 min，沉淀層用去離子水洗至中性，在3 000 r/min條件下離心20 min，冷凍干燥，即得核桃餅粕分離蛋白。

1.3.2 核桃蛋白酶解液蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

采用BCA法[20]測(cè)定蛋白質(zhì)含量。

1.3.3 核桃蛋白水解度的測(cè)定

采用甲醛滴定法[21]測(cè)定水解度。取5 mL核桃蛋白水解液，加25 mL去離子水，恒溫磁力攪拌15 min，用0.05 mol/L NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液調(diào)整pH至8.2，加10 mL中性甲醛溶液，混勻，用0.05 mol/L NaOH溶液調(diào)整pH至9.2，記錄消耗的氫氧化鈉體積。另取30 mL去離子水，做空白試驗(yàn)。試樣中氨基氮含量按式（1）計(jì)算。

式中：X為試樣中氨基氮含量，g/mL；V1為試樣中加入甲醛溶液后消耗NaOH標(biāo)準(zhǔn)液的體積，mL；V2為空白試驗(yàn)加入甲醛溶液后消耗NaOH標(biāo)準(zhǔn)液的體積，mL；V3為試樣稀釋液用量，mL；C為試樣中NaOH標(biāo)準(zhǔn)液的濃度，mol/L；0.014為氮的毫克當(dāng)量。

總氮量乘以氮的換算系數(shù)6.25為蛋白質(zhì)含量。氨基氮含量與總氮含量的比值為水解度。

1.4 單因素試驗(yàn)

1.4.1 酶解過程中溫度對(duì)核桃蛋白水解度的影響

分別取5 mL核桃分離蛋白溶液于5支試管中，加10 000 U/g堿性蛋白酶，調(diào)整pH至9.0，分別在溫度35，40，45，50和55 ℃條件下恒溫水解6 h。以蒸餾水代替核桃分離蛋白溶液為零管，記錄試驗(yàn)數(shù)據(jù)。根據(jù)不同酶解溫度對(duì)核桃蛋白水解度的影響進(jìn)行分析，得出最適的溫度。

1.4.2 酶解過程中pH對(duì)核桃蛋白水解度的影響

分別取5 mL核桃分離蛋白溶液于5支試管中，加10 000 U/g堿性蛋白酶，分別在pH 8，8.5，9，9.5和10，溫度50 ℃條件下恒溫水解6 h。以蒸餾水代替核桃分離蛋白溶液為零管，記錄試驗(yàn)數(shù)據(jù)。根據(jù)不同pH對(duì)核桃蛋白水解度的影響進(jìn)行分析，得出最適的pH。

1.4.3 酶解過程中時(shí)間對(duì)核桃蛋白水解度的影響

分別取5 mL核桃分離蛋白溶液于5支試管中，加10 000 U/g堿性蛋白酶，調(diào)整pH至9.0，分別在50 ℃恒溫水浴中分別水解3，4，5，6和7 h。以蒸餾水代替核桃分離蛋白溶液為零管，記錄試驗(yàn)數(shù)據(jù)。根據(jù)不同酶解時(shí)間對(duì)核桃蛋白水解度的影響進(jìn)行分析，得到最適的時(shí)間。

1.4.4 酶解過程中酶添加量對(duì)核桃蛋白水解度的影響

分別取5 mL核桃分離蛋白溶液于5支試管中，調(diào)整pH至9.0，加入堿性蛋白酶，加酶量分別為4 000，6 000，8 000，10 000和12 000 U/g，于50 ℃恒溫水解6 h。以蒸餾水代替核桃分離蛋白溶液為零管，記錄試驗(yàn)數(shù)據(jù)。根據(jù)不同酶添加量對(duì)核桃蛋白水解度的影響進(jìn)行分析，得到最適的加酶量。

1.5 正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，分別選取每個(gè)變量的3個(gè)最優(yōu)水平，按表1進(jìn)行正交試驗(yàn)，確定堿性蛋白酶對(duì)核桃蛋白的最佳水解條件。

表1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

利用軟件記錄試驗(yàn)數(shù)據(jù)，計(jì)算核桃蛋白的水解度，并用Origin軟件繪圖。正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果采用正交設(shè)計(jì)助理IIV 3.1進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 核桃蛋白中蛋白質(zhì)的含量的測(cè)定

BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。線性回歸方程為y=0.897 37x+0.078 46，R2=0.996 78。

圖1 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 溫度對(duì)核桃蛋白水解度的影響

如圖2所示，在35，40，45和50 ℃時(shí)，隨溫度的升高，水解度呈上升趨勢(shì)，在50 ℃時(shí)達(dá)到最高值，在50～55 ℃時(shí)逐漸趨于平緩。酶促反應(yīng)與其他化學(xué)反應(yīng)相同，隨溫度的升高，反應(yīng)速率隨之增強(qiáng)。故核桃蛋白水解反應(yīng)最適酶解溫度為50 ℃。

圖2 酶解溫度對(duì)核桃蛋白水解度的影響

2.3 pH對(duì)核桃蛋白水解度的影響

如圖3所示，隨pH的增加，水解度呈上升趨勢(shì)，達(dá)到最高點(diǎn)后緩慢下降，當(dāng)pH為9時(shí)水解度達(dá)到最高值。過酸、過堿均造成酶空間結(jié)構(gòu)的破壞，甚至使酶變性而喪失活力。由此得出核桃蛋白水解反應(yīng)最適pH為9。

圖3 pH對(duì)核桃蛋白水解度的影響

2.4 酶解時(shí)間對(duì)核桃蛋白水解度的影響

如圖4所示，隨酶解時(shí)間的增加，水解度呈上升趨勢(shì)，在3～5 h時(shí)水解度隨時(shí)間增加而增大，在5～6 h時(shí)達(dá)到最高點(diǎn)，在6～7 h時(shí)水解度隨時(shí)間的增加呈平緩趨勢(shì)。由此得出核桃蛋白水解反應(yīng)最適酶解時(shí)間為6 h。

圖4 酶解時(shí)間對(duì)核桃蛋白水解度的影響

2.5 酶添加量對(duì)核桃蛋白水解度的影響

如圖5所示。酶添加量在4 000～8 000 U/g時(shí)，水解度隨加酶量的增加而升高；當(dāng)酶添加量為10 000 U/g時(shí)，水解度達(dá)到最高值；在10 000～12 000 U/g之間，水解度趨于平緩趨勢(shì)。由此得出核桃蛋白水解反應(yīng)的最適加酶量為10 000 U/g。

圖5 酶添加量對(duì)核桃蛋白水解度的影響

2.6 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

由表2可知，影響核桃蛋白水解的各因素主次順序?yàn)镃＞D＞B＞A，即酶解時(shí)間＞酶添加量＞pH＞酶解溫度。根據(jù)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果可得5號(hào)A2B3C1D2為最優(yōu)方案，即核桃蛋白的最佳水解條件為酶解時(shí)間5 h、酶添加量10 000 U/g、pH 9.5、酶解溫度50 ℃；最佳水解度為21.2%。水解度越大，水解條越好。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果和極差分析

由表3可知：當(dāng)p＜0.05時(shí)，以酶解溫度為誤差項(xiàng)，經(jīng)方差分析，得出酶解時(shí)間和酶添加量對(duì)核桃蛋白水解度的影響差異顯著，pH與溫度對(duì)其影響差異不顯著。

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析

3 結(jié)論

試驗(yàn)采用堿溶酸沉法提取核桃粕核桃蛋白，用甲醛滴定法測(cè)定核桃蛋白的水解度，以水解度為指標(biāo)，對(duì)不同酶解溫度、pH、酶解時(shí)間和酶添加量對(duì)水解度的影響進(jìn)行單因素試驗(yàn)，并通過正交試驗(yàn)對(duì)其進(jìn)行優(yōu)化。最終確定的核桃蛋白最佳水解條件為酶解時(shí)間5 h、酶添加量10 000 U/g、pH 9.5、酶解溫度45 ℃，其最佳水解度達(dá)到21.2%。試驗(yàn)為核桃蛋白的深加工和利用、開發(fā)相關(guān)功能性食品提供一定的理論依據(jù)。