干酪苦味肽的形成及脫苦方法研究進展

司闊林，李志國，李玲玉，任敏，趙中華，宗學醒

內蒙古蒙牛乳業（集團）股份有限公司（呼和浩特 011500）

干酪（Cheese）種類繁多，可達2 000種以上，且營養物質豐富。干酪是一種主要以牛乳作為原料，通過天然菌株進行自然發酵成熟或者人為添加發酵劑而制成的食品，整個過程需凝乳排出乳清[1]。成熟期是形成干酪特有的色澤、風味、質地和組織狀態的過程，其中的蛋白質降解被視為最重要的生化反應。成熟過程中蛋白質（基本為酪蛋白）在凝塊中殘留的凝乳酶、乳自身含有的蛋白酶和發酵劑及非發酵劑的蛋白酶系統協同作用下，分解生成小分子肽和游離氨基酸（圖1）[2]，但是蛋白質降解過度或在水解不利的情況下會產生苦味肽，反而影響干酪的風味，如Cheddar干酪、Gouda干酪、Camembert干酪和Cream干酪等常見的干酪[3-4]。因此，研究干酪成熟過程中蛋白質的降解有利于控制干酪的質量[5]。研究就干酪苦味肽形成機理、苦味肽和苦味的關系和影響因素、特點及脫苦方法進行綜述。

1 干酪苦味的形成及影響因素

1.1 苦味肽形成機理

成熟期前的新鮮干酪是沒有苦味的，且公認苦味是蛋白質水解不當引起的。但是早期有人認為苦味是蛋白質水解過程中游離氨基酸的增加引起的，直到1952年，Murray等[6]通過研究表明干酪苦味是由蛋白質降解為肽而產生的，隨后更多研究者普遍證實了這一觀點。如圖1所示，蛋白質在干酪成熟過程中首先被凝乳酶等降解為大分子多肽，進而被細菌蛋白酶和肽酶降解生成小分子肽和游離氨基酸。在此過程中，酪蛋白的降解程度不斷增加以及降解過程中大部分源于αs1-酪蛋白和β-酪蛋白的中間產物沒有被充分進一步降解時，苦味肽就會產生（圖2）[7]。而當積累的苦味肽濃度超過一定閾值后，干酪就將產生苦味。

1.2 影響干酪中苦味肽形成及苦味程度的因素

1.2.1 影響苦味肽形成的因素

由圖1和圖2可知，干酪成熟過程中不管是蛋白質降解還是苦味肽的形成都與蛋白酶緊密有關，相關的蛋白酶系統主要有（圖3）[8]：（1）凝結劑（例如凝乳酶、胃蛋白酶、微生物或植物酸性蛋白酶）；（2）牛奶（纖溶酶，可能還有組織蛋白酶D和其他體細胞蛋白酶）；（3）來自發酵劑的酶；（4）非發酵劑或繼代培養物（例如P.camemberti，P.roqueforti，Propionibacterium sp.，B.linens和其他棒狀桿菌）的蛋白酶-肽酶系統；（5）用于促進成熟的外源蛋白酶或肽酶。而干酪成熟條件如鹽濃度、pH、成熟溫度和水分含量等通過影響酶活性和微生物的生長繁殖也會間接影響到苦味肽的形成。

圖1 干酪成熟過程中的蛋白質降解途徑

圖2 干酪中苦味肽形成的蛋白質反應圖

圖3 干酪中乳酸菌蛋白水解酶系統示意圖

1.2.1.1 凝乳酶

凝乳酶主要作用于αs1-酪蛋白和β-酪蛋白而產生苦味肽，其中αs1-酪蛋白富含脯氨酸，是由199個氨基酸殘基構成的單鏈磷酸化蛋白質，最易被凝乳酶降解為苦味肽；β-酪蛋白亮氨酸192-酪氨酸193被凝乳酶降解后釋放的苦味肽β-酪蛋白（f193-209）也會引起Gouda等干酪的苦味[9]。此外，干酪中苦味肽的含量也和凝乳酶的類型、添加量和殘留量有關。王玲[10]對木瓜蛋白酶、微生物凝乳酶和小牛皺胃酶制作的牦牛乳硬質干酪苦味進行比較，結果表明木瓜蛋白酶干酪在Pre-αs-酪蛋白區域有較強的蛋白帶，且αs-酪蛋白和β-酪蛋白降解程度以及苦味均顯著高于微生物凝乳酶和小牛皺胃酶干酪。劉忠成等[11]研究表明Quark干酪的苦味與凝乳酶添加量和成熟時間呈顯著正相關。

1.2.1.2 發酵劑乳酸菌

發酵劑乳酸菌在整個干酪成熟過程中起著至關重要的作用，其中的發酵劑蛋白酶主要通過降解β-酪蛋白而產生苦味肽[12]。并且不同類型的發酵劑乳酸菌制作的干酪所產生的苦味肽含量和苦味程度也有所差異。劉瑛等[13]分別使用3種不同發酵劑制作牦牛乳硬質干酪，研究了干酪形成后6個月成熟期內蛋白質降解和苦味形成的關系，結果表明蛋白質降解與干酪苦味呈正相關關系，嗜熱發酵劑成熟的干酪中蛋白質降解程度最大，3～6個月成熟過程中疏水性肽大量增加且苦味最強。因此，有些研究者會選擇合適的脫苦發酵劑制作干酪，盡可能地避免產生苦味。

1.2.1.3 成熟條件

在低鹽干酪中，苦味肽更易產生，食用鹽不僅可以在口感上掩蓋苦味，還可以抑制β-酪蛋白水解，從而減少苦味肽相關物質的產生[14]。成熟溫度和時間可以顯著影響蛋白質降解程度。宋雪梅[15]研究表明5，10和15 ℃成熟牦牛乳硬質干酪中的苦味肽在相同濃度時，15 ℃成熟干酪中疏水性氨基酸含量最高且苦味肽的苦味最為明顯。王玲[10]研究表明干酪在成熟3個月后苦味差異開始顯著，4個月后苦味已經不能被接受。

1.2.2 苦味和苦味肽之間的關系

干酪的苦味程度取決于苦味肽形成和分解的速度[16]，且苦味主要是由苦味肽中的疏水性氨基酸引起的，特別是長鏈的芳香族氨基酸殘基所致。影響苦味肽苦味強度的因素主要有4點：1）與疏水性氨基酸含量有關。Ney[17]在1971年提出了Q規則——Q=ΣΔf/n（其中Q為多肽平均疏水性值，Δf為氨基酸的自由能改變量，n為短肽中氨基酸數目），表明肽的苦味主要與其疏水度有關，而不是其特殊的氨基酸。但是Q規則只能定性地判斷短肽苦與不苦，不能確定其苦味強弱。2）與多肽氨基酸序列有關?？辔峨腃-和N-末端一般均為疏水性氨基酸殘基，但是殘基種類有所不同，C-末端主要為色氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸殘基，而N-末端則主要為精氨酸、賴氨酸、組氨酸殘基，當這些殘基距離多肽鏈很近時就會形成一個特殊的回轉結構，從而導致較強的苦味出現。多肽中的回轉結構對于苦味的形成很重要，而脯氨酸則是維持回旋結構的重要氨基酸，所以當脯氨酸較多時，多肽的苦味就較強烈。3）多肽苦味的強弱程度還取決于多肽相對分子質量的大小和其肽鏈長度。使用Q規則可以定性判斷分子質量小于6 000 Da的多肽是否具有苦味。4）一般來說，多肽苦味還與一些親水性基團及氨基酸殘基的存在與否有關。

綜上所述，多肽的苦味受多種因素影響，其中多肽的氨基酸組成和結構對其苦味的影響較大。

2 苦味肽的分離純化方法及組成特點

2.1 苦味肽分離純化方法

在進行苦味多肽的研究時，往往需要將其從原料中提取出來，也就是分離純化。由于多肽提取受各種因素的制約，在實際操作中有一定難度，而為了獲得較多高純度的多肽，則不能依靠單一的方法，需要將多種分離、純化方法聯合起來進行操作。目前用于分離苦味肽的方法主要為萃取法：溶劑萃取和有機溶劑萃取，最為常見的分別是Harwalkar等[18]的氯仿-甲醇法和Edwards等[19]的乙醇沉淀法。純化方法主要為凝膠色譜法、膜分離法和反相高效液相色譜（RP-HPLC）法等。1）凝膠色譜法。因為使用此法可以將活性肽快速分離并保證其活性，且操作比較簡單、回收率高，所以常被用來分離純化活性肽及一些其它活性分子。宋雪梅等[20]利用Sephadex G-25葡聚糖凝膠將牦牛乳硬質干酪苦味肽分離成3個不同相對分子質量的組分。2）膜超濾法。這種方法因為只能根據相對分子質量大小進行分離，所以更適合粗多肽的提取，如果想獲得高純度的多肽，還需要結合其他方法進行。分離原理就是比較相對分子質量和膜孔徑的大小，根據截流完成分離目的。3）RP-HPLC法。目前苦味肽分離純化中最常用的方法，具有快速、高效和高靈敏度的特點，疏水性相對較強的分子與固定相之間的相互作用較強而不易洗脫，而疏水性較弱的分子會先流出。Topcu等[21]利用超濾、凝膠色譜和RP-HPLC分別從Turkish白干酪和Kasar干酪分離純化并鑒定了不同片段的苦味肽。

2.2 苦味肽的組成特點

在分離純化出干酪中的苦味肽后，國內外不同學者對苦味肽的分子質量、氨基酸組成和通過人工合成苦味肽等方面研究了其組成特點。研究表明不同類型干酪的苦味肽的大小是有所差異的，比如Cheddar干酪中苦味肽的分子質量為190 Da[22]，而Camembert干酪的苦味是由400～3 000 Da大小的肽引起的[23]。宋雪梅等[20]通過分離鑒定牦牛乳硬質干酪苦味肽后發現，組分Ⅱ中有14種苦味肽，其中800～1 500 Da的苦味肽占64.29%，且含有大量的幾乎來自β-酪蛋白降解物的疏水性氨基酸尤其是Pro，這也與之前的研究結果基本一致[24-25]。此外，Otagiri等[26]通過合成多種含有不同氨基酸殘基（精氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸）的苦味肽類，分析不同肽類中氨基酸殘基的排列順序對苦味的影響，結果表明堿性氨基酸殘基精氨酸對苦味有影響?？偠灾?，干酪中苦味肽的分子質量范圍在100～6 000 Da之間，而且疏水性氨基酸對于干酪中苦味肽呈現苦味是必要的。

3 干酪脫苦方法

盡管苦味是蛋白質水解的必然結果，但仍然可以通過掩蓋、去除或預防來減輕苦味。因為干酪中的酪蛋白具有其獨特的流變特性，使得很多脫苦方法不適用于干酪生產中。而且在干酪的實際生產過程中，還會有很多復雜的變化，所以需要對3個關鍵步驟進行把控，首先最關鍵的步驟就是選擇水解酪蛋白的蛋白酶，其次是在此基礎上嚴格把控水解過程中的各種參數，最后是根據干酪特有的性質選擇合適的方法，最終達到脫苦的目的。脫苦方法的選擇對于干酪最終的口感和性狀至關重要，目前已經有多種方法被用于干酪生產中，主要包括選擇性分離法、包埋掩蓋法和生物脫苦法等，其中生物脫苦法由于具有多種優勢而被廣泛研究應用，在干酪生產中具有廣闊的應用前景。

3.1 選擇性分離法

選擇性分離法是一種可以有效控制干酪苦味的方法。苦味肽由于特有的高疏水性，使其對于活性炭等吸附類物質具有很強的吸附力，利用這一原理就能有效去除苦味肽，但是同時也會去除其中的必需氨基酸，從而造成一些營養物質如蛋白質的損失。如0.5 g/g活性炭吸附疏水氨基酸后，會造成26%±2%蛋白氮的丟失，這主要是由于活性炭對色氨酸和苯丙氨酸或含有色氨酸和苯丙氨酸的多肽的選擇性吸附；此外用有機溶劑異丁醇萃取雖然基本脫苦，但是也損失5%～10%的蛋白水解產物[27]。由于經濟限制或毒理學考慮，目前還沒有去除苦味肽的商業方法。

3.2 包埋掩蓋法

通過一些能構成包埋結構的掩蓋劑能掩蓋苦味，是一種常用的傳統脫苦方法[27]：1）環糊精，具有包裹苦味氨基酸疏水功能的能力。但是需要大量的α-環糊精溶液才能基本上掩蓋合成肽的苦味，不僅增加了生產成本還影響了產品的口感和質地，同時也會導致部分蛋白氮的損失；2）變性淀粉，利用其“網狀結構”覆蓋苦味化合物，并阻止它們到達苦味感受器部位。然而，為了達到這個目的，需要將淀粉和苦味肽的混合物加熱到100 ℃過夜；3）聚磷酸鹽，可以有效地掩蓋酪蛋白水解物的苦味，但是價格昂貴，不適合工業化生產；4）酸性氨基酸，苦味可以被天冬氨酸或谷氨酸掩蓋，但也會給產品帶來一定的酸味。大量的?；撬崛芤号c其他酸性氨基酸一樣地有效地降低氨基酸的苦味并且沒有酸味，同樣也不適用于工業化。

3.3 生物脫苦法

生物脫苦法主要包括酶法和脫苦發酵劑法。

3.3.1 酶法

酪蛋白是一種重要的蛋白質，其在干酪形成過程中有至關重要的作用，因為其富含脯氨酸而脯氨酸水解過程中不易被外切酶水解，所以一般在酪蛋白中對脯氨酸起水解作用的是一些脯氨酸特異性肽酶，這類肽酶使得干酪加速成熟而減少苦味口感。還有一些外切酶也對水解過程及減弱苦味起重要作用，主要包括氨肽酶和羧肽酶。并且這類外切酶從肽鏈的不同氨基末端開始水解氨基酸，氨肽酶從氨基末端開始水解，而羧肽酶從羧基末端開始水解，隨著此過程的進行，疏水性氨基酸從肽鏈中游離出來，使得苦味減弱。如今已從不同的乳酸菌中分離純化到這種外肽酶，比如從L.caseisubsp casei LGG中分離純化得到兩種肽酶，分別是脯氨酸氨肽酶和X-脯氨酰二肽基肽酶。這類酶已被證實具有特異性水解脯氨酸的能力，之后又針對胰蛋白酶降解的β-酪蛋白進行了研究，結果表明這兩種肽酶可以將β-酪蛋白中的苦味肽進行有效去除[28]。Umetsu等[29]通過小麥羧肽酶從苦味肽的羧基末端釋放Δf值大于6 697 J·mol-1的疏水性氨基酸，從而將水解產物當中的苦味物質去除并使得最終消化液中肽類的平均疏水性下降。Bouchier等[30]從L.lactisssp. cremoris AM2中分離純化得到脯氨酸氨肽酶，并證實此酶可以有效地對β-酪蛋白中的苦味肽進行脫苦。因此可以在干酪生產過程中添加外肽酶以脫苦，但是由于此類酶會產生大量的游離氨基酸（主要是疏水性的），可能會影響蛋白水解物的食品質量，因此使用這些外肽酶的脫苦法也有一定的局限性。

3.3.2 脫苦發酵劑法

國內外已有很多研究證實，許多微生物因為其獨特的肽酶體系，因此可以水解一些產生苦味的肽類物質，從而使得產品中苦味減弱或消失。并且這類微生物具有多種優點，如分布廣、種類多、生長快和繁殖旺等，而且其代謝產物可以大量積累，這就為獲取此類肽酶提供了基礎，較來源于動植物的端肽酶更容易被分離純化。宋蘭蘭等[31]為了達到降低低鹽干酪苦味的目的，以原料乳和Cheddar干酪為對象進行菌株篩選，共篩選獲得21株乳桿菌，又分別對產酸能力、水解能力和環境適應性等進行研究，最終獲得3株（C5、C8和C9）適用于低鹽干酪生產的菌株。Minagawa等[32]利用Thermus aquaticusYT-1的熱穩定和金屬依賴性氨基肽酶T特異性的特性，有效地減少甚至消除用3種蛋白酶（枯草桿菌蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰蛋白酶）獲得的酪蛋白水解產物中存在的肽組分的苦味。Shimamura等[33]利用9種乳酸菌發酵劑中的無細胞提取物（CFE）降解來自酪蛋白的苦味肽，其中4株菌株的降解活性超過90%，之后又選擇L.lactisssp. lactis 527的亞細胞部分進行試驗，結果表明細胞質和細胞膜部分對苦味肽有較高降解活性。屈倩[34]在制作低鹽Cheddar干酪之前，選擇了5株乳酸菌菌株測試其對苦味肽的降解活性，結果表明5株菌株的CFE均可以降解苦味肽，降解活性在19.60%～73.82%之間，而且降解活性很大程度上與乳酸菌類型相關，其中菌株M5對于苦味肽的降解活性高達73.82%。因此，篩選具有降解苦味肽能力的發酵劑成為干酪脫苦的一個重要方向。

3.4 其他脫苦法

除了以上幾種常見的干酪脫苦法，還有其他一些不常用的脫苦法，如類蛋白法[35]，在適當的條件下，將部分水解的蛋白質（如酪蛋白）與某種蛋白水解酶一起培養會形成“類蛋白”（一種類似蛋白質的高分子物質，其性質與原始蛋白質完全不同，這種類蛋白反應在獲得無苦、溫和的蛋白質類食品原料方面非常有效，但缺點是產量低和可逆性產生苦味）。此外，也可以通過改進干酪加工工藝進行脫苦，如在微氨化環境中制作干酪后的3～10 d，將表面模制的軟奶酪（Camembert干酪）培養在外層中使pH快速升高，干酪青霉生長較慢，蛋白水解較弱，苦味降低，缺點同樣是條件苛刻，不適合工業化生成[27]。

4 結語

干酪具有很高的營養價值，越來越受到消費者的喜愛，消費范圍也在逐年擴大。干酪的種類繁多，成熟過程是一個極其復雜的生化反應過程，其中蛋白質降解是干酪日常生產中最為復雜的反應之一，而且蛋白質降解對干酪的成熟及成品干酪的質地與口感具有重要影響。酪蛋白的水解對于干酪成品的品質具有重要意義，如果水解不當，就容易產生苦味物質，這不僅會影響干酪口感，還會降低其營養價值，對于生產銷售而言都是重大的打擊。因此，通過對干酪苦味肽的形成機理、影響因素及組成特點進行深入的研究，在此基礎探討有效去除干酪苦味的方法，可為提高干酪產品的質量及指導實際生產過程提供理論參考。