QuEChERS EMR-Lipid結合LC/MS/MS測定水產品中15種喹諾酮類抗生素

張穎 ，陳璐，趙巧靈*，湯海鳳，吳益春，陳靜

1. 浙江海洋大學食品與醫藥學院（舟山 316022）；2. 舟山市食品藥品檢驗檢測研究院（舟山 316013）

水產養殖業是我國漁業中不可或缺的組成部分，其中大黃魚是中國九大海水魚之一。根據《中國漁業統計年鑒》數據顯示[1]，2018年中國海水魚類養殖產量149.5萬 t，其中大黃魚養殖量最大，達到19.80萬 t。但是隨著水產養殖產業快速發展，也存在關鍵養殖技術欠缺、育苗成活率偏低、產品質量安全存在隱患等突出問題。眾所周知，2006年“多寶魚事件”，在養殖大菱鲆中檢出違禁藥物，使得海水養殖產業遭到沉重打擊。因此，在海水養殖環節中，漁藥過量使用或禁用漁藥違法添加引起的藥物殘留問題構成危害水產品質量安全的主要問題。

喹諾酮類藥物[3-4]屬于廣譜抗生素，可有效預防和治療多種傳染病，在水產養殖領域中被廣泛應用，在GB 31650—2019中規定魚中恩諾沙星等抗生素藥物最大殘留限量100 μg/kg。近年來，喹諾酮類檢測的相關文獻中，凈化除脂的主要方法有固-液萃取法[5-6]、固相萃取法[7-9]、QuEChERS[10-11]等，其中冷凍除脂和固相萃取法耗時過程較長，QuEChERS法具有快速、準確、靈敏、高效等特點而被廣泛應用于獸藥殘留的檢測。Enhanced Matix Removal Lipid（EMRLipid）[12-15]，是一種根據油脂類（如游離脂肪酸、磷脂、甘油三酯等）結構特點有效去除脂質的新型QuEChERS凈化劑，其能減少脂質基質對獸藥的吸附干擾。該技術尚未見用于養殖水產品中喹諾酮類獸藥檢測的報道。試驗以水產養殖中最常用抗生素喹諾酮類藥物作為研究對象，以大黃魚為代表作為研究基質，基于QuEChERS EMR-Lipid結合液質聯用技術，建立養殖水產品中15種獸藥殘留的快速檢測方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

G4220B/G6470A三重四極桿液相色譜質譜聯用儀（美國安捷倫科技有限公司）；Multi Reax多管式旋渦混合器（德國Heidolph公司）；AVANTIJ-E高速離心器（BECKMAN COULTER公司）；N-EVAPTM-111氮吹濃縮儀（美國歐加農公司）；KQ-600DV超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；QGARD00R1超純水機（法國Millipore）。

15種喹諾酮類抗生素（見表1）標準品的純度均大于94.0%，購自上海安譜科學儀器有限公司；乙腈、甲醇（德國默克股份良合公司）；甲酸（上海安譜科學儀器有限公司）；增強去脂萃取鹽包（m（無水MgSO4）∶m（NaCl）=4∶1）；增強型去脂分散凈化管（EMR-Lipid dSPE管，1 g，15 mL）。

標準儲備液：精確稱取15種喹諾酮類標準品，以乙腈作為定溶液，配制標準混合液100 μg/mL，冷凍貯藏（-18 ℃）。使用時，以含0.1%甲酸的10%乙腈溶液作為定溶液，梯度稀釋成5個濃度點的標準液。

1.2 樣品前處理

稱取2 g（精確至0.01 g）均質后的大黃魚樣品于50 mL聚丙烯離心管中，加入陶瓷均質子（2粒），先加入2 mL 1%甲酸水溶液后渦旋2 min，再加入8 mL 1%甲酸乙腈溶液，接著加入增強去脂萃取鹽包，快速渦旋振蕩2 min分散均勻，超聲15 min，以3 000 r/min離心5 min；取上層液轉移到QuEChERS EMR-Lipid dSPE管中，快速渦旋2 min，以5 000 r/min離心5 min；取上清液到15 mL離心管中，于50 ℃水浴氮吹至干。加1 mL 10%乙腈溶液（含0.1%甲酸）進行復溶，超聲溶解后過0.22 μm濾膜，供UPLC-MS/MS測定。

1.3 色譜-質譜條件

色譜柱采用Eclipse Plus C18（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；流動相A采用0.2%甲酸水溶液，流動相B采用0.2%甲酸乙腈溶液。梯度洗脫程序：0～0.5 min，2% B；0.5～1.8 min，2%～15% B；1.8～6.0 min，15%～25% B；6.0～6.5 min，25%～20% B；6.5～7.0 min，20%～30% B；7.0～11.0 min，30%～35% B；11.0～16.0min，35%～100% B；6.0～20.0 min，100% B。流速0.5 mL/min；進樣量5.0 μL。

質譜條件：氣體溫度350 ℃；氣體流量5 L/min；霧化器壓力45 psi；鞘氣溫度350 ℃；毛細管電壓正4 500 V，負3 500 V；噴嘴電壓正500 V，負500 V。電噴霧電離正模式（ESI+）；檢測模式采用MRM模式。15種化合物的監測離子對（m/z）、豐度比、去簇電壓、碰撞能等參數見表1。

表1 15種喹諾酮抗生素的質譜條件

2 結果與討論

2.1 質譜條件優化

為獲得15種喹諾酮類抗生素的質譜最優參數，選擇正離子模式下進行一級質譜掃描，獲得精準母離子（m/z），優化15種化合物的毛細管電壓和去簇電壓參數；為獲得15種化合物的2個或以上的子離子（m/z），進行全掃描，以二級質譜獲得最高豐度和第二高豐度的碎片離子分別作為定量離子和定性離子，并優化15種化合物的碰撞電壓，使得每種化合物離子對強度達到最大，15種抗生素優化的質譜參數見表1。

2.2 流動相優化

比較4種不同流動相（甲醇-水溶液，乙腈-水溶液，乙腈-5 mmol/L乙酸銨水溶液和0.2%乙腈-0.2%甲酸水溶液）對15種化合物的響應、峰形和分離效果的影響。結果表明，依諾沙星在甲醇-水溶液中不能被有效分離，添加乙酸銨的流動相依諾沙星響應較低，流動相中加0.2%甲酸可顯著提高15種化合物的豐度值。因此，選用0.2%乙腈-0.2%甲酸水溶液作為流動相，15種喹諾酮類抗生素（1 μg/mL）的選擇性離子流圖見圖1。

圖1 15種喹諾酮類抗生素（1 μg/mL）的選擇性離子流圖

2.3 提取溶劑優化

查閱相關文獻報道，喹諾酮類抗生素分析中多采用乙腈作為提取溶劑。大黃魚是高蛋白高脂肪的水產魚種，乙腈對高脂肪高蛋白的基質可達到有效提取目標化合物的目的；同時考察在提取溶劑中加入適量甲酸提高抗生素的提取效率。比較3種提取溶劑，分別為乙腈、1%甲酸乙腈溶液和1%甲酸乙腈水溶液（V（乙腈）∶V（水）=4∶1），對抗生素藥物的回收率影響。由結果可知，1%甲酸乙腈水溶液提取效果最優，15種喹諾酮抗生素回收率在83.5%～106.4%。因此，選用1%甲酸乙腈水溶液作為提取溶液。

2.4 線性關系與檢出限

在1～200 ng/mL線性范圍內進行標準曲線檢測，從表2中可知，15種喹諾酮類抗生素在相對應濃度范圍內線性關系良好，相關系數（r2）＞0.998（除依諾沙星之外）。以3倍信噪比（S/N=3）計算檢出限（LOD），15種喹諾酮類抗生素的LOD為0.5～2.0 μg/kg。

2.5 方法的回收率與精密度

選取空白大黃魚樣品分別進行3個水平的加標回收和精密度試驗（n=6）。由表2可知，在加標濃度范圍內，15種目標物的平均回收率為75.8%～112.3%，δRSD為2.3%～10.2%。方法的準確度和重復性均滿足定量分析的要求。

2.6 實際樣品測定

采用試驗建立方法對購買于市場上6種養殖水產樣品，包括大黃魚、鯽魚、鳊魚、大菱鲆、黃顙魚、黑魚，進行測定。經檢測發現，恩諾沙星、氧氟沙星在大黃魚、大菱鲆中均有檢出，恩諾沙星檢出含量在20～80 μg/kg，氧氟沙星檢出含量在10～50 μg/kg，結果表明所建立的方法能滿足日常檢測需求。

表2 15種待測物的線性方程、相關系數、方法檢出限、回收率和精密度

3 結論

基于QuEChERS EMR-Lipid凈化技術結合UPLCMS/MS技術用于水產品中15種喹諾酮類抗生素的快速檢測，采用1%甲酸乙腈水溶液作為提取溶液，經過EMR-Lipid的高效去脂凈化過程，有效提高方法的靈敏度和準確度，成功應用養殖水產樣品中15種喹諾酮類抗生素的檢測，具有較好的適用性和應用性。