固相萃取-超高效液相色譜法測定橄欖油中角鯊烯含量

李文，王偉 ，關榮發*，張玉，李雪，沈國新

1. 中國計量大學生命科學學院（杭州 310016）；2. 浙江省農業科學院（杭州 310016）；3. 木本油料品質營養國際聯合實驗室（杭州 310016）

角鯊烯（Squalene）又名鯊烯、鯊萜、角鯊油素、魚肝油萜，是一種高度不飽和的開鏈三萜類化合物，屬脂質不皂化物。角鯊烯具有促進心血管健康[1]、防癌抗癌[2]、抗抑郁[3]、解毒[4]、免疫[5]以及用于藥物緩釋[6]等方面的健康功效，但相關系統性的臨床研究還較為有限。角鯊烯主要來源于深海鯊魚肝油，植物性產品橄欖油中的角鯊烯含量較高，除了橄欖油[7]之外，其他植物油如南瓜籽油[8]、油茶籽油[9]、莧菜種子油[10]、香薷籽油[11]、靈芝孢子油[12]也或多或少含有角鯊烯。伴隨著角鯊烯在不同生物質中的發現，國內外學者對角鯊烯的含量和生物活性的研究也相繼展開。

橄欖油中角鯊烯的分析測定主要包括樣品前處理與定量定性分析。樣品前處理方法有傳統提取和新型提取兩類。其中有機溶劑提取法[13]、皂化法[14]為傳統提取方法，固相萃取法[15]、固相微萃取法[16]和超臨界CO2萃取法[17]為新型前處理方法。關于角鯊烯的檢測技術，有氣相色譜（Gas chromatography，GC）法[18]、高效液相色譜（Performance liquid chromatography，HPLC）法[19]、超高效液相色譜（Ultra high performance liquid chromatography，UPLC）法[20]、氣相色譜-質譜（Gas Chromatography-Mass Spectrometer，GC-MS）法[21]等。但這些方法或是將油脂甲酯化[22]，直接測定甲酯化后的產物；或是將油脂皂化衍生化后進行氣相色譜分析，操作溫度較高，測定過程可能會破壞樣品分子結構；或是需要超臨界流體輔助，操作步驟繁瑣、前處理時間長、試劑用量大，不能達到角鯊烯快速檢測的要求。超高效液相色譜具有普通高效液相色譜所不具有的超高的分離度、速度和靈敏度，能夠與不同的檢測器聯用從而對不同物質中的角鯊烯進行分析，與氣相色譜相比又無需高純氣體輔助、無需衍生化處理、無需較高溫度，操作更簡便。固相萃取消除了極性化合物、色素等的干擾，凈化了樣品，同時保護了超高效液相色譜系統。此次試驗采用固相萃取結合超高效液相色譜檢測技術，比較9種固相萃取小柱提取、凈化、富集橄欖油中的角鯊烯，進行橄欖油中角鯊烯簡便、準確、快速的檢測。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

橄欖油（實驗室購買）；角鯊烯標準對照品（純度＞98.0%，東京化成工業株式會社），購自梯希愛（上海）化成工業發展有限公司；甲醇、乙腈（色譜級），默克股份有限公司；正己烷、乙酸乙酯、三氯甲烷、丙酮（分析級）、甲酸（色譜級），均購自上海凌峰化學試劑有限公司；固相萃取凈化柱：Diol凈化柱（1 g/6 mL）、Florisil PR凈化柱（1 g/6 mL）、Silica凈化柱（1 g/6 mL）、Alumina-N凈化柱（1 g/6 mL）、NH2凈化柱（1 g/6 mL）、CN凈化柱（1 g/6 mL）、Carb凈化柱（1 g/6 mL）、PSA凈化柱（1 g/6 mL）、PA凈化柱（1 g/6 mL），購自上海Welchrom公司；0.22 μm有機微孔濾膜；電子分析天平，精度為0.1 mg；Anke TDL-5-A型臺式離心機，轉速≥3 000r/min；TM-2 Wiggens渦旋振蕩器，轉速≥2 000 r/min，德國維根斯；Supelco固相萃取儀；TTL-DCI型氮吹儀；Uplc I-class型超高效液相色譜儀配紫外（Ultraviolet，UV）檢測器，美國Waters公司；超純水（18.2 MΩ·cm），由青島富勒姆科技有限公司超純水器制。

1.2 橄欖油樣品前處理

準確稱取0.12 g（精確至0.001 g）橄欖油樣品于10 mL離心管中，加入0.6 mL正己烷，渦旋混合均勻，待凈化。上樣前，首先用10 mL正己烷對固相硅膠萃取凈化柱進行預淋洗；然后將待凈化橄欖油樣品上樣至固相硅膠萃取凈化小柱上，以1滴/s的速度通過已活化過的固相萃取柱；再用10 mL正己烷分2次潤洗離心管，然后轉移至固相硅膠萃取凈化小柱上，以1滴/s的速率洗脫角鯊烯，收集上樣流出液和洗脫液，在室溫下氮氣吹干，殘余物用2 mL甲醇復溶，過0.22 μm有機微孔濾膜轉移至進樣小瓶，待超高效液相色譜紫外檢測器（Ultra high performance liquid chromatography-平共處Ultraviolet，UPLC-UV）檢測。

1.3 色譜分析條件

色譜柱Acquity UPLC BEH C18（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）；流動相為100%乙腈，等度洗脫，流速為0.20 mL/min；柱溫為30 ℃；進樣量為2 μL；紫外檢測器檢測波長為210 nm。

1.4 標準溶液配制

角鯊烯標準儲備液（1 600 μg/mL）的制備：準確稱取0.080 0 g（精確至0.000 1 g）角鯊烯標準品，加適量甲醇，振搖，使角鯊烯溶解后，再加甲醇定容至50 mL容量瓶中，充分振蕩溶解，過濾，儲存在棕色瓶中4 ℃以下保存備用。使用時可根據需要稀釋成不同濃度，現用現配。

角鯊烯標準工作液的制備：精密量取適量角鯊烯對照品儲備液，加甲醇逐級稀釋成9，90，360，720和1 200 μg/mL的梯度角鯊烯系列標準溶液。

2 結果與分析

2.1 前處理條件優化

2.1.1 固相萃取凈化柱的選擇

要將橄欖油中角鯊烯進行很好的分離凈化，固相萃取柱填料的選擇是試驗的核心。由于角鯊烯極性較小，利用不同類型固相萃取小柱對角鯊烯的保留強度不同，此次試驗比較了Diol、FL、SI、AL-N、NH2、CN、Carb、PSA、PA 9種類型的固相萃取柱對待分析物角鯊烯富集的影響。按1.2方法進行處理，最后采用UPLC-UV分析檢測角鯊烯含量。

結果表明，9種類型凈化柱處理得到的角鯊烯均得到了良好分離，9種固相萃取小柱凈化角鯊烯的色譜圖如圖1所示。其中經SI、PSA、Diol、FL固相柱處理得到的橄欖油樣品，雜峰較少。凈化效果最好的為SI凈化柱，其次為FL、Diol、PSA。選擇正己烷作為固相萃取柱活化洗脫劑，Diol凈化柱、AL-N凈化柱、NH2凈化柱、CN凈化柱、Carb凈化柱、PSA凈化柱、PA凈化柱、FL凈化柱作為角鯊烯分離純化固相萃取小柱時，部分油脂也被洗脫下來，其中經Carb凈化柱、PSA凈化柱處理的橄欖油樣品，被洗脫下來的油脂為無色透明油脂，以上8種均未達到油脂與目標物角鯊烯良好分離的目標。

SI凈化柱對橄欖油樣品進行前處理的結果表明，極性吸附劑硅膠將甘油三酯成分很好地保留在吸附劑上，而首先將待分析物角鯊烯洗脫下來，未發現油脂被洗脫下來，凈化效果良好。在1.3色譜分析條件下對同一橄欖油樣品進行檢測，經硅膠柱處理得到的角鯊烯回收率最高。經9種固相萃取小柱凈化處理檢測到的角鯊烯回收率如圖2所示。因此，選擇硅膠凈化柱進行橄欖油中角鯊烯的分離純化。

2.1.2 洗脫溶劑的選擇

選擇SI硅膠凈化柱，在同樣洗脫體積下，考察洗脫劑A（正己烷）、洗脫劑B（V（正己烷）∶V（乙酸乙酯）=9∶1）、洗脫劑C（V（正己烷）∶V（乙酸乙酯）=8∶2）、洗脫劑D（V（正己烷）∶V（三氯甲烷）=5∶1）、洗脫劑E（丙酮）5種不同洗脫溶劑對角鯊烯純化的影響。結果表明：在5種不同洗脫溶劑處理下的UPLC-UV圖譜中，角鯊烯均分離良好且峰型尖銳，但經過洗脫劑B（V（正己烷）∶V（乙酸乙酯）=9∶1）、洗脫劑C（V（正己烷）∶V（乙酸乙酯）=8∶2）、洗脫劑D（V（正己烷）∶V（三氯甲烷）=5∶1）、洗脫劑E（丙酮）洗脫，SI硅膠凈化柱的色譜圖中雜峰較多，回收率低，因此選用洗脫劑A（正己烷）進行角鯊烯洗脫，其效果最佳，結果見圖3。

圖1 9種固相萃取柱凈化處理角鯊烯色譜圖比較

圖2 9種固相萃取柱凈化處理檢測到的角鯊烯回收率

圖3 不同洗脫劑對角鯊烯回收率的影響

2.1.3 洗脫體積的選擇

以正己烷溶劑為洗脫劑，試驗比較了不同的洗脫體積對角鯊烯回收率的影響，洗脫曲線見圖4。結果表明：當洗脫溶劑正己烷體積＜10 mL時，角鯊烯回收率隨洗脫體積的增大而增大；當洗脫體積≥10 mL時，角鯊烯回收率趨于平穩。故采用10 mL正己烷作為洗脫劑。

圖4 不同洗脫體積對角鯊烯回收率的影響

2.2 UPLC分析條件的確定

在UPLC分析中，色譜的分離和數據的采集是同時進行的。為了使角鯊烯組分達到較好分離，必須選擇合適的色譜分析條件，例如流動相、流速、柱溫、色譜柱類型。

2.2.1 流動相的選擇

在流速0.20 mL/min、柱溫30 ℃、紫外檢測波長210 nm、進樣量2 μL的相同條件下，改變流動相，考察甲醇[23]、甲醇-水、乙腈、乙腈-水[24]、甲醇-甲酸水[25]體系對分離效果的影響。

在甲醇100%、甲醇-水、甲醇-0.2%甲酸水體系、乙腈100%、乙腈-水等流動相下，UPLC-UV色譜圖表明，經9種類型的固相萃取凈化柱處理的橄欖油樣品中目標物角鯊烯均與其他雜峰分離良好。在甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.2%甲酸水體系中，隨著有機相比例的增加，保留時間逐漸縮短。在甲醇-水、甲醇-甲酸水、乙腈-水體系中，相同流動相配比下，乙腈-水體系下的角鯊烯保留時間最長。甲醇-水和甲醇-0.2%甲酸水體系下分離效果基本相同，而柱壓較低的乙腈-水流動相系統，更有助于保護UPLC色譜系統，故選擇乙腈-水流動相體系，考慮到柱子的使用壽命和樣品保留時間，選擇純乙腈為流動相。

2.2.2 流速的選擇

以純乙腈為流動相，色譜柱柱溫為30 ℃，紫外檢測器檢測波長為210 nm，進樣量為2 μL，考察不同流動相的流速（0.10，0.15，0.20，0.25和0.30 mL/min）對角鯊烯檢測的影響。

在0.10～0.30 mL/min流速范圍內，流速增大，角鯊烯的保留時間均縮短。當流速為0.10和0.15 mL/min時，角鯊烯出峰時間過長，且當流速為0.1 mL/min時角鯊烯存在拖尾現象。當流速＞0.20 mL/min時，角鯊烯出峰時間大大縮短但縫寬較窄。結合色譜系統壓力和角鯊烯保留時間，選擇0.20 mL/min作為流動相的流速。

2.2.3 柱溫的選擇

柱溫是重要的色譜操作條件之一，它直接影響色譜柱的選擇性、色譜峰區域展寬和分析速度。以純乙腈為流動相，流速為0.20 mL/min，紫外檢測波長為210 nm，進樣量為2 μL，考察不同柱溫（20，25，30，35和40 ℃）對橄欖油中角鯊烯分離的影響。結果如圖5所示。

圖5 不同柱溫下角鯊烯色譜圖

在20～40 ℃柱溫范圍內，峰形變化很小，樣品主峰與其他雜質峰均分離良好，樣品的保留時間隨著柱溫的升高均縮短。因柱溫太高易損傷色譜柱，綜合考慮樣品的保留時間、柱子的使用壽命以及經濟性和便利性等因素，柱溫選擇30 ℃。

2.2.4 色譜柱的選擇

由于角鯊烯極性很弱，適合用反相色譜柱，所以試驗選用C18的反相柱。考察Agilent ZORBAX SB-C18（2.1 mm×50 mm，1.8 μm）、ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）色譜柱對分離效果的影響。如圖6（a）所示，選擇Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱時，目標物角鯊烯分離良好，但角鯊烯峰對稱性不好；選用ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱時，角鯊烯峰型尖銳，對稱性好。綜合考慮，選擇ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）色譜柱進行角鯊烯的檢測分析。

圖6 不同色譜柱下角鯊烯色譜圖

2.3 方法學考察

2.3.1 標準曲線及檢出限

用1 600 μg/mL的角鯊烯標準儲備溶液，以甲醇為溶劑進一步稀釋，配制成質量濃度分別為9，90，360，720和1 200 μg/mL的角鯊烯標準工作液系列。以角鯊烯標準品的質量濃度作為橫坐標，角鯊烯的峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，如圖7所示。以信噪比S/N=3以及S/N=10對應的質量濃度分別作為檢出限（limit of determination，LOD）和定量限（limit of quantitation，LOQ），結果見表1。

圖7 角鯊烯標準曲線

表1 角鯊烯線性范圍及定量限

2.3.2 穩定性試驗

精確稱取0.12 g橄欖油樣品，經硅膠柱提取處理后用甲醇定容至2 mL，每隔3 h進樣2 μL，按照優化的1.3色譜條件進行定量分析。穩定性試驗結果見表2。δRSD為0.049%，說明用該方法制成的供試樣品溶液中的角鯊烯在24 h內穩定。

表2 穩定性試驗結果

2.3.3 精密度試驗

精密度是衡量可靠性的另一個指標。在優化的色譜條件下，連續進樣6針角鯊烯標準品，進樣精密度試驗結果見表3。精密度δRSD為0.440%。

表3 精密度試驗結果

2.3.4 回收率試驗

加標回收率是表示準確度的一個指標。用已知角鯊烯含量（4 994.18 mg/kg）的橄欖油樣品進行添加回收率試驗。準確稱取9份0.12 g同一已知角鯊烯含量橄欖油樣品，每3份樣品為1組，每組分別準確加入高、中、低3個水平的角鯊烯標準品。樣品處理和角鯊烯的定量分析按1.2和1.3的優化條件進行。先測定添加樣品中的角鯊烯含量，減去已知角鯊烯含量（4 994.18 mg/kg）的橄欖油樣品，再計算添加回收率，加標樣品的回收率結果見表4。角鯊烯的加標回收率在98.38%～103.109%之間，平均添加回收率為100.836%，相對標準偏差δRSD為2.35%。表明該方法回收率較好，數據準確可靠。

2.3.5 重復性試驗

取某一種橄欖油，按照1.2條件進行樣品預處理，并在1.3色譜條件下進行檢測分析（平行試驗，n=6），并計算重復性相對標準偏差δRSD。結果如表5所示，重復性δRSD值為0.046%。結果表明在1.2的處理方法和1.3的色譜條件下，測定方法比較穩定，測定數據重現好。

表4 加標樣品的回收率結果

表5 重復性試驗結果

2.4 實際樣品測定

采用該方法對實驗室中來自澳大利亞、突尼斯、希臘、意大利的6種橄欖油進行檢測（平行試驗，n=3），角鯊烯含量在1 907.364～5 191.548 mg/kg之間，在Salvo等[26]研究的1 448～7 474 mg/kg角鯊烯含量范圍之內。由表6可知，在6種橄欖油中，澳大利亞特級初榨橄欖油中角鯊烯含量最高，達5 191.548 mg/kg，其次為編號2和1的意大利貝斯隆橄欖油，其中的角鯊烯含量分別為4 998.564和4 287.582 mg/kg。再次為希臘伊莉雅（4 048.285 mg/kg）和希臘卡利士多（3 577.879 mg/kg），突尼斯亨洛德莊園1#中角鯊烯含量為2 152.262 mg/kg，突尼斯亨洛德莊園2#中角鯊烯含量在所有油中含量是最低的（1 907.364 mg/kg），而同為澳大利亞的澳根尼橄欖油中角鯊烯含量僅2 047.671 mg/kg，說明橄欖油中角鯊烯的含量可能受地域和橄欖油品種的影響。

表6 實際樣品的測定

3 結論

橄欖油中角鯊烯含量的固相萃取-超高效液相色譜紫外檢測方法，具有操作簡便、準確度高、重現性好的特點。此次試驗探討了不同色譜柱、固相萃取凈化柱、流動相、流速、柱溫對角鯊烯含量的影響，利用優化方法快速定量檢測4個不同地區的6個品種的橄欖油中角鯊烯，其含量在1 907.364～5 191.548 mg/kg之間，這可能是由于種植環境和橄欖油品種不同所造成的。