LC-MS/MS測定豆芽中4-氯苯氧乙酸鈉和6-芐基腺嘌呤

李碧波，杜鵬程，裴娟娟

仙桃市公共檢驗檢測中心（仙桃 433000）

豆芽是日常生活中常見的蔬菜，不僅營養豐富，甚至還能治療一些常見病，有良好藥用價值[1-3]，深受人們喜愛。然而，一些豆芽的無良商家為達到高產量、高質量目的，生產過程中濫用各種違禁藥物，主要包括4-CPA-Na和6-BA等，對人體健康造成惡劣影響。根據國家市場監督管理總局食品安全抽檢公布結果查詢系統不完全統計，自2014年—2020年3月底，站內統計抽檢黃豆芽近7 500批次，綠豆芽近7 800批次，豆芽近4 100批次，總計約2萬批次。其中，不合格批次超過2 100批次，約占總數的10.8%，且不合格項主要涉及4-CPA-Na和6-BA，在食品安全監管領域是一個突出問題難題。

關于豆芽中的檢測方法主要以液相色譜法、液相色譜質譜聯用法為主，相關標準、文獻檢測方法[4-8]均采用不同方法對單一組分分別檢測，工作量大，難以滿足實際的檢測需要。同時測定的方法也有很多[9-11]，但在豆芽樣品的前處理過程中均涉及固相萃取小柱凈化或氮吹濃縮，使得前處理過程極其復雜繁瑣，降低檢測效率的同時，也增加污染風險。通過優化提取方法和凈化環節，只需將樣品提取、純化、稀釋即可進樣，結合液相色譜串聯質譜聯用儀高靈敏度特性，建立便捷高效的豆芽中4-CPA-Na和6-BA的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 主要儀器和試劑

Ultimate 3000液相串聯TSQ Quantum Access Max質譜系統（美國Thermo Fisher Scientific，配有格林威爾氮氣發生器）；臺式高速冷凍離心機（TGL16M，湘立科學儀器有限公司）；渦旋混合器（Vortex 3000，Wiggens）；組織搗碎機（博朗食品加工機FP 3010，Braun）；電子分析天平（MS205DU，瑞士Mettler-Toledo公司）；超聲清洗機（410HT，深圳潔拓科技）。

4-氯苯氧乙酸鈉（4-CPA-Na，標準品250 mg，純度≥99.0%，CAS NO 13730-98-80，美國阿爾塔）；6-芐基腺嘌呤（6-BA，標準品，純度≥99.38%，CAS NO 1214-39-7，Stanford chemicals）；甲醇、乙腈（色譜純，Fisher Chemical）；C18粉末（博納艾杰爾科技有限公司）；其他試劑（均為國藥集團化學試劑有限公司）；PCX小柱（艾杰爾混合陽離子交換小柱）。

豆芽樣品（流通環節監督抽檢樣品）。

1.2 樣品前處理

取適量豆芽樣品用博朗食品加工機粉碎均勻后封存備用。準確稱取10.000 g處理好的豆芽樣品于50 mL聚丙烯離心管中，加入10 mL 5%乙酸乙腈，振搖1 min，超聲5 min，加入氯化鈉、無水硫酸鎂各1.0 g，渦旋振蕩2 min，8 000 r/min離心5 min，恢復室溫后，吸取5 mL上清液于15 mL離心管中，加入150 mg C18粉末，渦旋振蕩，以8 000 r/min離心5 min，恢復室溫后，吸取100 μL上清液，用空白基質提取液定容至1 mL，渦旋振蕩1 min，過0.22 μm針式過濾膜，供LCMS/MS分析。

同時選取不含4-CPA-Na、6-BA的豆芽樣品，按上述處理方法制備空白基質提取液。

1.3 標準系列溶液的配制

4-CPA-Na、6-BA標準品用十萬分之一天平分別準確稱取0.100 0 g；用合適溶劑溶解，甲醇定容；配制成4-CPA-Na、6-BA含量1.0 mg/mL標準儲備溶液。甲醇稀釋成100.0 ng/mL中間濃度作為混合標準使用溶液。分別準確吸取一定體積混合標準使用液于進樣瓶中，加空白基質提取液定容至1 mL，臨用時現配；配制成質量濃度依次為0.1，0.5，1.0，2.0，5.0和20.0 ng/mL的標準溶液系列。

1.4 儀器分析條件

液相色譜參數：色譜柱，賽默飛原裝Hypersil GOLD? C18（3 μm，150 mm×2.1 mm）；流動相A，5 mmol乙酸銨溶液；流動相B，乙腈；流動相流速0.30 mL/min；進樣體積20 μL。柱溫35 ℃。梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序

質譜各項性能參數見表2，目標化合物的SRM條件見表3。

表2 質譜參數條件

表3 4-CPA-Na和6-BA的SRM條件

2 結果與分析

2.1 樣品前處理方法的選擇

4-CPA-Na易溶于水、酸化甲醇和酸化乙腈；6-BA在甲醇和乙腈中的溶解度較高，難溶于水，但降低水系提取液中pH時，6-BA能達到穩定的溶解度；因此試驗考察分別用0.1 mol/L鹽酸、甲醇、乙腈作為提取液時4-CPA-Na和6-BA的加標回收率，同一濃度重復測定5次，加標回收率見表3。結果表明，3種提取溶劑都能兼顧4-CPA-Na和6-BA的加標回收率。以0.1 mol/L鹽酸作提取液時，因強酸溶液不能直接進入質譜檢測器，需使用PCX小柱固相萃取吸附、洗脫以置換溶劑，該過程可能造成目標化合物的丟失，致使回收率稍低，且使用固相萃取小柱會提高檢測成本，樣品凈化過程耗時更長。使用甲醇和乙腈作提取液時發現，乙腈作提取液時的目標化合物的峰型要更尖銳對稱，原因可能是豆芽中的蛋白含量及脂類含量要高于一般蔬菜，使用乙腈提取時能沉淀蛋白振蕩從而降低基質干擾。綜合考量，選用乙酸乙腈作為4-CPA-Na和6-BA的提取溶劑。超聲提取后加入氯化鈉，無水硫酸鎂使水相和樣品中水分和乙腈分層，離心后取上清液加入C18粉末凈化，能達到理想的提取凈化效果。根據液相色譜-串聯質譜基質效應及其消除方法[12]中傳統消除基質效應的方法，進樣前將樣品稀釋能減少本底進樣量達到進一步降低基質效應的目的。

2.2 質譜條件的優化

將4-CPA-Na和6-BA含量100.0 ng/mL的標準使用溶液通過注射泵直接進入質譜，進行正負離子全掃描，通過調整鞘氣流速、輔助氣流速、霧化溫度等使目標化合物的母離子m/z得到最優響應值。

4-CPA-Na在負離子模式下響應值穩定，采用負離子掃描模式；6-BA可產生[M+H]+離子峰m/z226，也可產生[M-H]-離子峰m/z224，正負離子掃描均有響應，同一濃度時離子峰m/z226響應值優于m/z224，見圖1和圖2；6-BA在正離子掃描模式下靈敏度更高，應選用離子峰m/z226。選擇反應監測（SRM）模式，自動優化Tube Lens、碰撞能量，得到幾對不同的離子對，選取184.98＞127.0，184.98＞141.10作為4-CPANa定量、定性離子，226.07＞91.2，226.07＞65.3作為6-BA定量、定性離子。

表4 不同提取溶劑4-CPA-Na和6-BA回收率

圖1 6-BA負離子模式下的母離子圖

圖2 6-BA正離子模式下的母離子圖

2.3 色譜條件的優化

優化色譜條件需要考慮色譜峰的峰型、分離效果及保留效果等參數的影響，色譜柱及流動相的選擇起關鍵性的作用。通過比較Hypersil GOLD? C18（3 μm，2.1 mm）色譜柱150 mm和100 mm 2款，結果發現100 mm色譜柱在保留效果、分離效果上較低，目標化合物出峰快，與樣品中存在的雜質未有效分離，會降低電噴霧接口處4-CPA-Na和6-BA的離子化效率，影響質譜檢測靈敏度；150 mm色譜柱的峰型、分離效果及保留效果良好，2種化合物能達到一定分離度，且保留時間比較合適，有利于分析判斷。因此選擇Hypersil GOLD? C18（3 μm，150 mm×2.1 mm）色譜柱。

流動相方面分別考察純水、添加0.1%甲酸水、乙酸銨水溶液及添加0.1%甲酸的乙酸銨水溶液作為流動相A，以乙腈作為流動相B。試驗發現，用純水+乙腈體系作為流動相時4-CPA-Na和6-BA峰型均存在嚴重峰拖尾現象，化合物之間互相干擾，影響檢測結果的準確性。以5 mmol/L乙酸銨水溶液或添加體積分數0.1%甲酸水溶液作為流動相A時，峰型得到明顯改善，但流動相中存在甲酸時4-CPA-Na離子強度受到明顯抑制，乙酸銨水溶液存在于流動相中時6-BA離子強度有一定抑制，通過降低乙酸銨水溶液濃度6-BA離子強度逐步增強，乙酸銨水溶液濃度為5 mmol/L時達到最優。最終選定5 mmol/L乙酸銨水溶液+乙腈作流動相，梯度條件洗脫。

2.4 方法檢出限、定量限及線性關系

通過LC-MS/MS分析基質空白提取液、加標樣品、基質匹配標準溶液系列，得到空白樣品、加標樣品的SRM譜圖，如圖3和圖4所示；標準曲線、線性方程如圖5所示。結果表明，4-CPA-Na和6-BA在0.1～20 ng/mL質量濃度區間有良好線性關系。

根據林國斌等[13]方法檢出限的確定，根據公式方法檢出限（MLD）=k×Sb×C/X計算，其中，C為標液濃度；k為置信因子，一般取3，確定4-CPA-Na檢出限位0.4 μg/kg，6-BA檢出限0.125 μg/kg；依據定量限（LOQ）與方法檢出限（MLD）的近似數量關系a（MLD）∶a（LOQ）=4∶10得到4-CPA-Na的定量限1.0 μg/kg，6-BA定量限0.50 μg/kg。

圖3 空白樣品4-CPA-Na和6-BA的SRM譜圖

圖4 加標質量濃度0.5 ng/mL時4-CPA-Na和6-BA的SRM譜圖

圖5 標準曲線圖

2.5 精密度和回收率

選取不含4-CPA-Na、6-BA的豆芽樣品，分別添加1.0，5.0和20.0 ng/mL 3種水平進行加標回收測試，按試驗方法進行處理、測試；平行重復測定5次，得到平均回收率、相對標準偏差（RSD），見表5。

2.6 樣品檢測

對流通環節抽檢的50個豆芽樣品進行分析，4批次樣品檢出含有4-CPA-Na或6-BA，其中4-CPA-Na 3次檢出，最高含量2.24 μg/kg，6-BA 2次檢出，最高含量0.97 μg/kg?？傮w不合格率達到8.0%，可見豆芽中2種藥物濫用現象嚴重，必須加強監管。

表5 4-CPA-Na和6-BA平均回收率和精密度

3 結論

根據4-CPA-Na和6-BA特性，建立液相色譜質譜聯用系統測定豆芽菜中4-CPA-Na和6-BA含量的方法，通過比較各種樣品前處理方法，優化儀器條件，使整個試驗過程更加簡潔快速，且方法的靈敏度高，再現性好，完全滿足《國家食品安全監督抽檢實施細則》對于豆芽中2種藥物的檢測分析。