超高壓對仙人掌有孢漢遜酵母的損傷機理

雷雨晴，郝靜怡，吳 傲，甘芝霖，孫愛東

（1. 北京林業大學生物科學與技術學院，北京 100083；2. 林業食品加工與安全北京市重點實驗室，北京 100083）

0 引言

非釀酒酵母常出現在漿果表面，并可在果酒天然發酵早期發揮作用，影響酒類發酵質量，給產品帶來或積極或消極的影響[1-3]。根據其特性，可以分為好氧型、低發酵活性型、高發酵活性型三大類，其中最常見的品種為檸檬形克勒克酵母（Klockera apiculata）、有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum）兩種[4]。但在果蔬制品（果蔬汁、鮮果、非酒精性飲料等）中，非釀酒酵母的生長繁殖及代謝會產生乙醇等容易引起產品質變的成分，因而被視為腐敗菌種。熱處理是殺滅果蔬制品腐敗菌的常用手段，可以有效抑制其生長，但容易造成熱敏性活性物質的損失，并導致食品感官品質下降[5]。因此，以超高壓、脈沖電場等為代表的非熱殺菌技術開始被應用于食品加工領域，這些技術可以較好保持食品原有的品質[6-9]，同時滿足食品衛生要求。

超高壓（High Hydrostatic Pressure，HHP）是近年來被廣泛研究的一種冷殺菌技術，在海產品、肉類、果蔬加工等領域均已得到應用[10-14]。該技術不僅可以有效殺滅病原微生物、延長食品貨架期，還擁有改變食品性質得到新結構食品的可能性[14]。相比于傳統熱殺菌技術，超高壓有效克服了熱處理的弊端，在保證食品的微生物安全的基礎上，還可以較好地保持食品原有的質構、營養、風味以及新鮮度等，更加符合當前市場對保持食品原汁原味的消費需求[15]。超高壓對食品微生物的殺菌機理一直是近年來的研究熱點之一，目前超高壓對于細菌的殺菌研究較為全面和透徹，已有研究表明，高壓狀態下細胞膜損傷、活性氧水平的提升是導致細菌失活的原因[16]。對于酵母菌，研究報道超高壓對于釀酒酵母的殺菌效果較好，可以破壞細胞結構使得細胞壁碎片化，細胞質大量流出[17]，然而針對非釀酒酵母的殺菌研究卻十分少見，因此本文擬以一種非釀酒酵母-仙人掌有孢漢遜酵母為研究對象探究超高壓對其的損傷機理。

仙人掌有孢漢遜酵母是一種較為常見的非釀酒酵母，可從天然采收的葡萄等漿果中分離出來[18]，具有生產乙醇的能力并可導致漿果的腐敗[19-21]。漿果采收后，表面酵母菌的生長繁殖是導致其腐敗的主要因素，因此采取有效措施抑制非釀酒酵母的生理活性對提高產品的質量、減少價值損失具有重要意義。但目前針對殺滅仙人掌有孢漢遜酵母的研究鮮有報道，因此進行超高壓殺菌對其損傷機制的探究是十分必要。

本文中對仙人掌有孢漢遜酵母菌液進行超高壓處理，通過測定碘化丙啶染色情況、紫外260及280 nm吸光度、電導率等方式表征細胞膜損傷情況，利用圓二色譜儀、流式細胞儀等儀器探究超高壓對菌體胞內物質的影響，再基于掃描電鏡、透射電鏡觀察得到損傷菌的形態結構變化圖像，從試驗結果中推斷出可能的損傷機理，從而為非釀酒酵母的滅活研究打下基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌種及培養基：仙人掌有孢漢遜酵母（序列號FM199954.1），由本實驗室從早期腐敗的愛國者藍莓汁中自主分離純化，采用方法參考本實驗室Zhu等[22]的研究內容；麥芽汁瓊脂（Malt Extract Agar，MEA）培養基、麥芽汁培養基（Malt Extract Medium，MEM），北京奧博星生物技術有限責任公司。

磷酸緩沖鹽溶液（Phosphate Buffered Saline，PBS，pH值5.6）、氯化鈉、碘化丙啶（Propidium Iodide，PI）、戊二醛、吖啶橙（Acridine Orange，AO），北京拜爾迪生物技術有限公司；超微量ATP酶試劑盒（Na+/K+、Ca2+/Mg2+、T-ATP酶），南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設備

CAU-HHP-700-7型超高壓設備，包頭科發高壓科技有限責任公司；TS-100B型搖床，上海天呈實驗儀器制造有限公司；SW-CJ-2D型超凈臺，中興儀器設備有限公司；LDZX-30KBS型立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫療器械；TM-03筆型電導率儀，上海儀電科學儀器股份有限公司；UV 6100型紫外-可見分光光度計，上海元析儀器有限公司；BD FACS Calibur型流式細胞儀，上海普迪生物技術有限公司；Quanta FEG250型掃描電子顯微鏡，美國Sprite biotwin有限公司；Fei tecnai G2型透射電子顯微鏡，美國Sprite biotwin有限公司；Chirascan plus型圓二色光譜儀，美國Photo Physics儀器公司。

1.3 方法

1.3.1 菌液制備

挑取仙人掌有孢漢遜酵母單菌落接種至2 mL PBS緩沖液中，混勻后取0.5 mL菌懸液加入150 mL MEM培養基，28 ℃搖床180 r/min培養16 h，將培養好的菌液離心（5000 r/min，10 min，4 ℃）去上清液，用PBS清洗菌體兩次，重懸，調整菌液濃度為106～107CFU/mL備用。

1.3.2 超高壓處理

將樣品置于7 L的超高壓密閉圓筒中，以水為傳壓介質，水溫不超過25 ℃，升壓速率與降壓速率分別為3.3 MPa/s和133.3 MPa/s。恒定壓力500 MPa，處理150、300、450、600 s；恒定處理時間300 s，設定壓力100、200、300、400、500 MPa 。升降壓時間不算在處理時間內。

1.3.3 微生物計數方法

采用GB 4789.15—2016《食品微生物學檢驗：霉菌和酵母計數》的方法檢測酵母細胞總數。即將菌液用PBS緩沖液梯度稀釋至合適濃度后取0.1 mL通過涂布法接種在MEA培養基上，在（28±0.1）℃培養箱中培養48 h后計數。用酵母菌死亡數lgS表示殺菌效果，公式如下

式中N0表示處理前酵母菌數量，N表示處理后酵母菌數量，CFU/mL。

1.3.4 細胞膜完整性檢測

參考Huang等[23]的方法進行細胞膜完整性檢測。樣品用PI染料（終質量濃度為5μg/mL）在4 ℃下染色10 min后用PBS洗滌2次備用。用流式細胞儀測定熒光強度，激發和發射波長分別設置為495 nm和615 nm。

1.3.5 細胞膜通透性檢測

核酸的共軛雙鍵在紫外260 nm處有最大吸光度，蛋白的苯環結構在280 nm處有最大吸光度，因此通過光度法測定菌液上清液的OD260nm及OD280nm值可以顯示核酸與蛋白泄漏情況[24]，即將處理后的菌懸液離心（4 ℃，5000 r/min，10 min），取上清液分別在260和280 nm波長條件下測定吸光度。利用電導率儀測定上清液電導率。

1.3.6 胞內酶活檢測

用超微量ATP酶試劑盒進行測定，參照試劑盒方法：將處理前后菌液在冰水浴中超聲破碎（功率200 W，工作時間2 s間隔3 s，工作次數100）得菌體裂解液，稀釋至合適濃度后進行酶促反應，與試劑混勻后于37 ℃反應10 min，離心（3500 r/min，10 min）取上清液，靜置5 min后在636 nm處測定吸光度。胞內酶活力單位以prot計，表示為U/mg。

1.3.7 蛋白質變性檢測

參考Zhong等[25]的方法，用圓二色譜儀進行測定。將1.3.6中獲得的菌體裂解液離心（4 ℃，8000 r/min，15 min），取上清液置于圓二色譜儀進行測定，比色皿厚度0.1 cm，譜帶寬度1.0 nm，分辨率0.2 nm，掃描波長范圍200～250 nm。

1.3.8 遺傳物質變化檢測

AO染料可以對酵母菌細胞中的DNA和RNA進行染色并測定含量[26]。將樣品用AO染液（終質量濃度為5μg/mL）于37 ℃避光染色10 min，用PBS沖洗兩次洗去多余染料。用流式細胞儀檢測其熒光強度，設置激發波長495 nm，發射波長615 nm，狹縫寬度10 nm。

1.3.9 掃描電鏡（Scanning Electron Microscope，SEM）與透射電鏡（Transmission Electron Microscope，TEM）觀察

SEM與TEM樣品前處理：將處理前后菌懸液離心（4 ℃，5000 r/min，10 min）后棄去上清液，菌體用無菌超純水清洗兩次后置于體積分數2.5 %戊二醛中，在4 ℃冰箱中固定12 h后用PBS（pH值5.6）漂洗3次。進行梯度乙醇脫水，30%、50%、70%、90%乙醇各一次，100%乙醇兩次，10 min/次。

對于SEM樣品，乙醇脫水后用30%、50%、70%、90%和100%叔丁醇溶液逐級取代乙醇，真空冷凍干燥后噴金觀察。掃描電鏡下電子束加速電壓10 kV，放大倍數5000倍。

對于TEM樣品，乙醇脫水后進行常規滲透，用樹脂包埋聚合后進行超薄切片（厚度70 nm），經染料染色后上鏡觀察[27]。

1.4 數據處理

每組試驗做3次重復，用Excel軟件處理數據，并使用SPSS 21.0軟件進行方差分析、Duncan多重比較及獨立樣本t檢驗（P＜0.05），試驗結果表示為平均值±標準差。

2 結果與分析

2.1 超高壓處理對仙人掌有孢漢遜酵母的滅活效果

如圖1所示，當壓力在200 MPa以下時，幾乎無滅活效果，300 MPa時酵母菌死亡數顯著（P＜0.05）提升至4.36 lg(CFU/mL)，壓力繼續增大時死亡數緩慢升高，推測300 MPa處為高壓致死轉折點；處理時間小于300 s時，已有較好的滅活效果，死亡數達4.30 lg(CFU/mL)，當處理時間延長時，酵母菌死亡數反而下降，這可能是由于菌體在高壓刺激下產生了應激防御[28]而導致的。考慮到超高壓短時處理殺菌不徹底易產生亞致死狀態的細胞[29]（是一種存活但非可培養狀態，又稱“假死”狀態），同時300 s處為死亡數下降的轉折點，因此選定300 MPa、300 s作為后續超高壓處理的條件。

2.2 超高壓處理對細胞膜的影響

2.2.1 超高壓處理對細胞膜完整性的影響

PI是一種可以通過損傷細胞膜與細胞DNA結合發出紅色熒光的染料，而完整細胞則不會被其染色，常用于細胞活性鑒定[30]。圖2結果顯示，未處理細胞幾乎不被PI染色，而超高壓處理后則有70.50%的細胞被染色，以上結果表明，300 MPa超高壓條件導致了細胞膜損傷。研究表明，細胞膜最重要的功能就是作為選擇性屏障保護細胞內部結構，膜完整性受損會導致細胞質流出和膜蛋白失活，進而引發細胞死亡[31]。

2.2.2 超高壓處理對細胞膜通透性的影響

當微生物細胞處于不利環境時，會導致細胞內的K+、Na+等電解質外泄，從而導致菌懸液電導率提高[32]。根據表1可知，超高壓處理后，菌懸液電導率從4μS/cm增加至26μS/cm，表明細胞膜通透性升高，細胞內的離子發生外泄，導致電導率發生變化。

蛋白質和核酸作為細胞內重要的大分子物質，在膜通透性正常的情況下不會泄漏到細胞膜外，除非細胞膜通透性發生改變[33]。通過測定菌液離心后上清液在260、280 nm的吸光度可以反映其核酸、蛋白的泄漏情況，而胞內物質的泄漏程度可間接反映膜損傷的情況[34]。如表 1所示，超高壓處理可導致胞內大分子物質泄漏，OD260nm、OD280nm值分別提高至1.132、0.374。以上結果表明，超高壓處理酵母細胞膜壁造成了較為嚴重的破壞，導致細胞膜通透性升高，核酸和蛋白外泄，進而導致菌體死亡。

表1 超高壓處理對仙人掌有孢漢遜酵母電導率、紫外260與280 nm吸光度的影響 Table 1 Effects of HHP on conductivity, OD260nm and OD280nm of Hanseniaspora opuntiae

目前研究學者普遍認為，超高壓對微生物的滅活作用是由于其破壞了膜結構，與本文的結果相符。這可能是因為超高壓處理可使酵母細胞膜發生相變[35]，磷脂雙分子層上脂肪酰基鏈聚集，膜流動性降低[36]，使得自由基積累引發氧化應激反應[37]，從而造成酵母細胞的失活。

2.3 超高壓處理對細胞形態結構的影響

2.3.1 掃描電鏡觀察

掃描電鏡可反映不同處理后細胞外部形態結構的變化。在圖3中可以發現，未處理的仙人掌有孢漢遜酵母菌呈橢球狀，表面光滑完整；在超高壓處理后，菌體仍保持橢球狀，但表面不再光滑，出現凹陷、裂縫。根據Shimada等[38]的研究，室溫條件下，當壓力超過300 MPa時釀酒酵母的表面形態發生改變，且金屬離子開始發生外泄，這與本文的研究結果相似。這表明超高壓會導致細胞形態改變，這可能是細胞失活的原因之一。

2.3.2 透射電鏡觀察

透射電鏡可反映不同處理后細胞內部結構的變化。由圖4可知，未處理的酵母菌體有完整的細胞膜壁，可以看到清晰完整的細胞器，且細胞質均勻致密；經超高壓處理后，細胞膜出現明顯孔洞，細胞周質空間寬度增大，細胞器破裂，胞內物質大量外泄。Shimada等[38]研究中也發現了類似結果，超高壓處理后釀酒酵母內部結構受到影響，大多數細胞器被破壞。Hartmann等[39]通過建立釀酒酵母結構模型發現，壓力作用在細胞壁上會引起嚴重的非靜水壓力，這可能與膜結合蛋白變性等失活機制相關，而非靜水壓力會被傳遞到細胞內部并保持穩定，當壓力達到415～460 MPa時達到臨界值，此時可觀察到細胞壁損傷，但由于試驗用菌種不同，臨界值也會存在差異。

結合掃描電鏡和透射電鏡圖像可以發現，超高壓處理會導致膜結構的破壞，增強了細胞膜的通透性，使膜結構穿孔或開裂，從而造成菌體內容物泄漏，同時超高壓處理會導致胞內細胞器結構被破壞，無法進行正常的生理活動，最終導致了酵母的死亡。

2.4 超高壓處理對胞內物質的影響

2.4.1 超高壓處理對胞內酶活力的影響

Na+/K+- ATP酶和Ca2+/Mg2+-ATP酶廣泛存在于高等真核生物的質膜上，分別負責驅動膜內外Na+和K+、Ca2+和Mg2+離子的對向運動，調節細胞滲透壓，從而維持細胞的穩態[40-41]，對信息運送和能量轉換等生理活動也具有重要意義[42]。由圖5可以看出，超高壓處理后，仙人掌有孢漢遜酵母胞內的Na+/K+- ATP酶、Ca2+/Mg2+-ATP酶和總ATP酶的活力和空白對照相比分別降低了31.13%，16.01%和20.06%（抑制率）。之前已有研究表明，超高壓處理會造成副溶血性弧菌[43]等菌種的ATP酶活降低。本研究結果顯示，超高壓同樣會使得仙人掌有孢漢遜酵母細胞膜ATP酶失活，從而導致胞內外離子運輸及能量供應失衡，使胞內多種生理代謝紊亂，導致菌體死亡。

2.4.2 超高壓處理對胞內蛋白質結構的影響

圓二色光譜的遠紫外區（200～250nm）屬于蛋白質中肽鍵的吸收范圍，包含著蛋白質主鏈的構象信息，可以觀測蛋白質的二級結構類型。根據圓二色譜結果可知（圖6），未處理的仙人掌有孢漢遜酵母菌液裂解液在208及222 nm處顯示有明顯α-螺旋的雙負峰[44]，但在216 nm處沒有β-折疊的特征峰，說明仙人掌有孢漢遜酵母菌胞內蛋白二級結構以α-螺旋為主。在經過超高壓處理后，仍未出現β-折疊的特征峰，但208 nm處峰強度降低，222 nm處的特征峰消失，說明超高壓處理均可以導致α-螺旋含量下降，對蛋白質二級結構造成影響。研究表明，超高壓技術在蛋白改性方面也有廣泛應用，導致α-螺旋和β-折疊結構含量改變，蛋白結構變得松散[45]。Gipsy等[46]的研究中也發現，超高壓會使蛋白二級結構改變。正常細胞內，細胞膜會傳遞壓力，但突破臨界值后細胞膜壁破裂，因此在超高壓處理時，細胞膜結構改變后壓力作用于細胞器及細胞質，可能是導致內部蛋白結構改變的原因。

2.4.3 超高壓處理對胞內核酸結構的影響

吖啶橙（AO）是一種特異性的熒光染料，具有膜通透性，可以自由透過細胞膜并與菌體細胞內的核酸物質結合[47]。AO與雙鏈DNA結合，發出綠色熒光；與RNA或者單鏈DNA結合，則發出桔紅色熒光。根據圖 7結果，超高壓處理后，單鏈核酸增加至60.75%，而雙鏈核酸降低至38.84%，表明超高壓處理對核酸結構有明顯影響。由此可知，核酸損傷是超高壓可能的殺菌機制之一。

3 結論

本研究分析了超高壓處理對仙人掌有孢漢遜酵母細胞的影響，通過對細胞膜、細胞形態結構、胞內物質變化的研究，探討了可能的損傷機理，研究結果如下：

1）超高壓處理對仙人掌有孢漢遜酵母有較好的滅活效果，300 MPa和300 s殺滅的菌落數為4.36 lg(CFU/mL)。在對其損傷機理的探究中發現，超高壓通過破壞仙人掌有孢漢遜酵母的細胞膜結構使得胞內核酸、蛋白、離子大量外泄，同時，在高壓的作用下，胞內Na+/K+- ATP酶、Ca2+/Mg2+-ATP酶和總ATP酶活均有所降低，胞內蛋白質二級結構改變、DNA解旋。因此，推測膜的破損、胞內物質的失活是超高壓損傷仙人掌有孢漢遜酵母的可能機制。

2）超高壓處理后仙人掌有孢漢遜酵母的生理指標有所改變，但本文研究還不夠深入，僅憑所測指標無法闡述損傷具體機制。后續試驗可以考慮借助組學研究手段，探究超高壓處理后該酵母菌基因層面的變化，從而探究菌體細胞在分子水平上對外界環境做出的應答反應以及相關機制。