沉默GTPBP4基因表達對食管癌細胞增殖、侵襲和化療敏感性影響*

張翠紅，呂欣，侯春立，張建軍，馬博敬，范才

050082 石家莊，解放軍聯勤保障部隊第九八〇醫院 放療科(張翠紅、張建軍、馬博敬、范才)， 腫瘤科(侯春立)；055450 河北 邢臺，柏鄉縣中心醫院 醫務科(呂欣)

癌癥是目前人類最致命的疾病之一，而食管癌在癌癥導致的死亡中排名第8，并且大約一半的病例發生在中國，食管鱗狀細胞癌占食管癌病例的90%[1-2]。手術輔以放化療的綜合治療手段是目前臨床絕大多數中晚期食管癌患者的主要治療措施，并且新輔助化療改善了食管癌患者的預后，大大提高了患者術后5年的生存率[3-4]。因此，如何有效提高腫瘤對化療藥物的敏感性已經成為當前食管癌研究的一個新方向。

GTP結合蛋白4(GTP binding protein 4，GTPBP4)是一種定位于核仁的新型G蛋白，參與核糖體60S亞基合成和成熟的鳥苷三磷酸酶(guanosine triphosphatase,GTPase)的一個新成員，與細胞增殖和生長密切相關，是近年發現的凋亡抑制基因[5-6]。目前僅少部分研究發現GTPBP4可能對結腸癌[7]、神經膠質瘤[8]的生物學行為有一定影響，但有關GTPBP4在食管癌中的研究相對較少，有關其在食管癌化療敏感性方面的研究更是鮮見。本研究首先通過GEO數據庫，分析食管癌患者組織中GTPBP4的表達情況，然后將LV-GTPBP4-siRNA干擾慢病毒轉染至食管癌EC109細胞，觀察沉默GTPBP4基因后對細胞增殖、細胞周期、侵襲能力及化療敏感性的影響，為食管癌基礎和臨床研究提供理論和實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人食管黏膜上皮細胞系(human esophageal epithelial cell,HEEC)及食管癌細胞系EC109、EC9706和KYSE-150均購自中國細胞資源庫(北京)，液氮中保存。DMEM培養基及胎牛血清FBS購自中國Gibco公司；pGCSIL-GFP/LV-GTPBP4-siRNA慢病毒載體購自上海吉凱基因科技有限公司；氟尿嘧啶(5-Fu，每支250 mg，批號：1236)，為天津金耀氨基酸有限公司產品；順鉑(100 mg，貨號：J-SD8810-100)，為上海研謹生物有限公司產品。CCK8試劑購自武漢默沙克生物科技有限公司；TRIzol試劑購自美國Invitrogen公司；PCR引物序列購自上海生工生物股份有限公司；cDNA反轉錄反應試劑盒和SYBY Green PCR試劑盒購自日本TaKaRa公司；Annexin V-FITC/PI雙染細胞凋亡試劑盒購自美國BD公司；兔多克隆抗體GTPBP4和辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)標記的山羊抗兔二抗購自中國武漢proteintech公司；細胞裂解及蛋白抽提試劑、蛋白濃度檢測試劑考馬斯亮藍、Western blot配膠試劑盒購自江蘇碧云天生物技術有限公司；PVDF膜、ECL發光液購自美國Millipore公司。Transwell小室購自美國Millipore公司；Matrigel購自美國BD公司。流式細胞儀購自美國BD公司；PCR擴增儀購自美國MJ Research Inc公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 人食管黏膜上皮細胞系HEEC及食管癌細胞系EC109、EC9706和KYSE-150均在含10%胎牛血清、1%青霉素/鏈霉素的DMEM培養基中培養，于37℃、5%CO2恒溫培養箱培養，用含0.25%的胰蛋白酶進行消化傳代。

1.2.2 實時熒光定量PCR(real-time quantitative pol-ymerase chain reaction,RT-qPCR)檢測GTPBP4mRNA的表達 收集對數生長期的4種細胞，按Trizol操作說明書提取細胞總RNA，檢測及確定核糖核酸濃度，使用逆轉錄試劑盒將總RNA逆轉錄為cDNA。GTPBP4基因的上游引物序列為5’-GATGAAGTATGGCG-ACTCTCTCT-3’，下游引物序列為5’-GTATTCGGATCAATGGTTGGCA-3’；內參照 β-actin的上游引物序列為5’-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3’，下游引物序列為5’-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3’(引物購自上海生工生物股份有限公司)。PCR反應條件：95℃ 2 min ；95℃ 15 s，60℃ 1 min ；共40個循環。實驗中每個樣品重復檢測3次，以2-ΔΔCt值表示目的基因的相對表達量。

1.2.3 Western blot檢測GTPBP4蛋白的表達 收集對數生長期的4種細胞，根據蛋白提取試劑盒操作說明提取細胞總蛋白，考馬斯亮藍法測定蛋白濃度，SDS-PAGE凝膠電泳分離，轉膜，封閉，加入一抗(GTPBP4：1∶1 000)，4℃搖床孵育過夜，加入HRP標記的山羊抗兔二抗IgG(1∶2 000)，室溫下孵育1.5 h，化學發光儀上進行顯色，β-actin作為內參，利用Image J圖像分析系統測定各條帶灰度值，以目的蛋白條帶灰度值與內參照β-actin條帶灰度值的比值表示目的蛋白的相對表達水平。

1.2.4 慢病毒感染EC109細胞 取處于對數生長期的EC109細胞，胰酶消化，制成細胞懸液，以1.5×105個/孔接種于6孔板中，37℃、5%CO2培養箱中培養至細胞融合度達到約30%；根據制造商的指南進行感染，感染復數值(multiplicity of infection,MOI)為10，加入適宜量LV-GTPBP4-siRNA病毒，設為干擾組(LV-GTPBP4-siRNA組);陰性對照組轉染含有非特異性干擾序列的陰性病毒(LV-NC組)；未做任何處理的細胞為空白對照組(NC組)。感染72 h后顯微鏡下觀察細胞熒光表達情況，熒光率大于80%，收集各組細胞提取RNA和蛋白，以實時PCR和Western blot檢測沉默效率；感染效率低于80%的實驗組，重新進行感染實驗。

1.2.5 CCK-8檢測細胞增殖能力 取慢病毒感染72 h后的3組EC109細胞，經胰蛋白酶消化成細胞懸液，以每孔1×105個細胞接種于96孔板中，每孔接種100 μL，每組設5個復孔，96孔板放入孵箱內繼續培養24、48、72 h 后，更換新鮮無血清培養基100 μL，各孔加入CCK-8 溶液10 μL，放入37℃孵箱繼續培養4 h，用酶標儀檢測450 nm波長處的吸光度(optical density, OD)，使用GraphPad Prism 7.0軟件繪制細胞生長抑制曲線。

1.2.6 流式細胞法檢測細胞周期分布 慢病毒感染后72 h的3組EC109細胞，胰酶消化并收集3組細胞，用PBS洗滌并重懸細胞，細胞密度為2×105個/mL，取1mL單細胞懸液，離心去上清，加入1mL 70%的預冷乙醇，4℃固定過夜。染色前用PBS洗滌2次，加入100 mg/L的RNaseA，37℃水浴30 min。再加入500 μL(50 mg/L)，碘化丙啶(propidium iodide, PI)染色液混勻，4℃避光反應30 min后，轉移至流式細胞儀進行檢測，每組重復3次。

1.2.7 CCK8檢測EC109細胞對化療藥物的敏感性 慢病毒感染72 h后收集NC組、LV-NC組和LV-GTPBP4-siRNA組細胞，接種于96孔板中，每孔約2×103個細胞，繼續培養24 h細胞貼壁后，分別加入0、12.5、25.0、50.0、100.0、200.0 μmol的順鉑，或0、25、50、100、200、400 μmol的5-氟尿嘧啶，其中0 μmol為對照組，同時設立空白組(只含培養基不含藥物和細胞)進行校正，每組樣品5個復孔。繼續培養48 h后，每孔加人CCK8溶液10 μL，繼續培養4 h，用酶標儀檢測450 nm波長處的OD值，細胞存活率(cell survival rate,CSR)=(ODLV-GTPBP4-siRNA組-OD空白組)/(ODNC組-OD空白組)×100%，細胞抑制率(cell inhibition,CI)=1-細胞存活率。使用GraphPad Prism 7.0軟件計算細胞的半數抑制濃度(50% inhibiting concentration,IC50)及繪制細胞存活率曲線。

1.2.8 Transwell小室實驗檢測細胞侵襲能力 用DMEM培養液將預包被基質膠Matrigel稀釋(1∶6)，取80 μL加入至Transwell上室，37℃放置過夜。慢病毒感染72 h后收集NC組、LV-NC組和LV-GTPBP4-siRNA組細胞，接種于6孔板中，每孔約5×104個細胞，繼續培養24 h，分別加入終濃度為3 μg/mL的順鉑，繼續培養48 h后，胰酶消化制備成每孔4×104個細胞懸液，接種至Transwel上室鋪勻(已鋪基質膠)，下室加入600 μL含20% FBS的DMEM培養液，在5% CO2、37℃培養箱中培養24 h，取出Transwell小室，用棉簽拭去聚碳酸酯膜表面的Matrigel膠，PBS沖洗，4%的多聚甲醛固定20 min，0.1%結晶紫染色30 min，PBS沖洗晾干，在熒光顯微鏡下計數穿過基質膠的細胞，以此反映細胞的侵襲能力。

1.3 統計學方法

2 結 果

2.1 GEO數據庫分析GTPBP4在人食管癌組織中的表達

GEO數據庫中分析16例人正常食管組織及配對16例食管癌組織中GTPBP4的表達情況。結果表明，人食管癌組織中GTPBP4明顯高于正常食管組織(P<0.001)(圖1)。 以上結果提示，GTPBP4基因作為癌基因，可能與食管癌的發生和發展相關。

圖1 GEO數據庫分析GTPBP4在人食管癌組織中的表達(****P<0.001)

2.2 人食管黏膜上皮細胞和食管鱗癌細胞系GTPBP4的表達

RT-qPCR和Western blot法檢測人食管黏膜上皮細胞系HEEC及食管癌細胞系EC9706、EC109和KYSE-150細胞GTPBP4mRNA和蛋白表達水平。EC9706、EC109和KYSE-150細胞GTPBP4mRNA相對表達水平分別為2.66±0.32、4.62±0.06、3.38±0.17，明顯高于HEEC細胞(均P<0.001)(圖2A)；EC9706、EC109和KYSE-150細胞GTPBP4蛋白相對表達水平分別為2.46±0.56、3.95±0.36、3.18±0.10，明顯高于HEEC細胞(P<0.01，P<0.001，P<0.001)(圖2B、C)，其中EC109細胞GTPBP4mRNA和蛋白表達水平較EC9706和KYSE-150細胞升高更為明顯，故以EC109細胞系作為進一步研究的對象。

圖2 人食管黏膜上皮細胞和食管鱗癌細胞系GTPBP4的表達(*** P<0.01,**** P<0.001)

2.3 GTPBP4基因沉默效果的測定

實時熒光定量PCR檢測結果顯示，與NC組(1.00±0.00)比較，LV-GTPBP4-siRNA組(0.62±0.06)EC109細胞中GTPBP4mRNA相對表達量明顯下降，差異有統計學意義(P=0.030)，NC組與LV-NC組之間的差異無統計學意義(P=0.930)(圖3A)。

Western blot法檢測結果顯示，與空白對照組(101.30±4.00)比較，LV-GTPBP4-siRNA組(48.22±2.84)EC109細胞中GTPBP4蛋白的相對表達量明顯下調，差異有統計學意義(P<0.001)，NC組與LV-NC組之間的差異無統計學意義(P=0.550)(圖3B、C)。

圖3 實時熒光定量PCR和Western blot法分別檢測沉默GTPBP4表達后EC109細胞中GTPBP4 mRNA和蛋白的表達水平變化(*P<0.05, **** P<0.001)

2.4 CCK8實驗檢測細胞增殖能力及流式細胞法檢測細胞周期

CCK8法分別比較24、48和72 h時3組細胞生長抑制率，雙因素方差分析，F組間=366.500，P<0.001，F時間=8 097.000，P<0.001，F組間×時間=98.410，P<0.001，差異有統計學意義。分別比較各時間點3組細胞生長抑制率，24 h時3組細胞的生長抑制率差異無統計學意義(P=0.094)；與NC組比較，LV-GTPBP4-siRNA組EC109細胞在48 h、72 h生長抑制明顯，差異有統計學意義(均P<0.001)，而NC組與LV-NC組之間的差異無統計學意義(P=0.063，P=0.063)。組間比較：與NC組相比，LV-GTPBP4-siRNA組細胞生長受到明顯抑制(P<0.001)(圖4A)。以上結果提示，沉默GTPBP4基因表達可使食管癌EC109細胞的增殖能力降低。

流式細胞法檢測結果顯示：與NC組比較(55.31±0.43)%，LV-GTPBP4-siRNA組EC109細胞周期G0/G1期的細胞數增多(70.62±1.21)%，而S期細胞數減少，分別為(26.10±0.76)%，(19.27±1.17)%，差異均有統計學意義(均P<0.001)(圖4B、C)。上述結果表明，沉默GTPBP4基因表達可誘導細胞出現G1期阻滯，從而抑制細胞的增殖。

圖4 CCK8法和流式細胞法檢測沉默GTPBP4基因對EC109細胞生長抑制和細胞周期的影響(**** P<0.001)

2.5 CCK8檢測EC109細胞對化療藥物的敏感性

慢病毒感染EC109細胞后加入不同濃度順鉑或5-氟尿嘧啶，結果表明，隨著藥物濃度增加，細胞的存活率逐漸下降。順鉑處理后NC組IC50為185.60 μmol/L，LV-GTPBP4-siRNA組IC50為150.10 μmol/L；5-氟尿嘧啶處理后NC組IC50為402.20 μmol/L，LV-GTPBP4-siRNA組IC50為203.10 μmol/L，兩者差異均有統計學意義(均P<0.05)(圖5)。結果表明，沉默GTPBP4基因表達后細胞對兩種化療藥物更加敏感。

圖5 CCK8法檢測沉默GTPBP4基因后EC109細胞的化療敏感性(**** P<0.001, *** P<0.01)

2.6 Transwell實驗檢測細胞侵襲能力

Transwell小室侵襲實驗檢測結果顯示，慢病毒感染EC109細胞后，細胞的侵襲能力發生了改變，與NC組(976.00±17.58)相比，LV-GTPBP4-siRNA組的穿膜細胞數量(518.00±54.49)明顯減少，差異有統計學意義(P<0.001)(圖6A、B)。慢病毒感染EC109細胞聯合化療藥物順鉑處理后，與NC組(701.00±84.66)相比，LV-GTPBP4-siRNA組的穿膜細胞數量(354.30±49.69)明顯減少，差異有統計學意義(P=0.001)(圖6C、D)。以上結果提示沉默GTPBP4基因表達，可明顯增加順鉑抑制食管癌細胞侵襲的能力，提高藥物敏感性。

圖6 Transwell侵襲實驗檢測沉默GTPBP4基因表達聯合順鉑對EC109細胞體外侵襲能力變化(****P<0.001，** P=0.001)

3 討 論

GTPBP4，也稱為慢性腎功能衰竭蛋白(chronic renal failure geneprotein，CRFG)，是由10號染色體長臂14-15區(10q15-14)編碼、由633個氨基酸組成的重要功能蛋白，是一種定位于核仁的新型G蛋白，故也稱作核仁GTP結合蛋白1(nucleolar GTP-binding protein 1,NOG1)[9-10]。當前，對于該基因的研究較少，許多機制功能需要進一步探究，目前研究顯示該蛋白主要參與核糖體60S亞基的合成和成熟，還和腎病末期的發展有密切關系[11-12]。但是對于該基因和腫瘤的關系研究較少。有研究發現，在神經膠質瘤細胞株中，GTPBP4表達水平下調，轉染GTPBP4過表達質粒后，可明顯降低雪旺氏細胞生長、DNA合成及裸鼠成瘤的能力，進一步研究發現，GTPBP4抑制細胞增殖的能力是通過調節Merlin蛋白、CyclinD1蛋白實現的，從而扮演抑癌基因角色[8]。但也有研究和上述結果不一致，在乳腺癌中，GTPBP4呈高表達，且與預后差、生存期短呈正相關[13-14]。另有研究發現：在胃癌組織、多種胃癌細胞株中GTPBP4表達均升高，GTPBP4高表達與胃癌患者的臨床分期、腫瘤侵襲、淋巴結轉移和遠處轉移密切相關，下調GTPBP4表達后，胃癌細胞株MKN-45及AGS的增殖能力及克隆形成減低、凋亡增加[15]，提示該蛋白可能在腫瘤中承擔潛在癌基因角色。

基于以上研究發現，GTPBP4在惡性腫瘤中的表達水平不同(下調或上調)，提示GTPBP4可能是一種癌基因或抑制基因，主要依賴于特定的腫瘤類型。而到目前為止，GTPBP4與食管癌關系及食管癌化療藥物敏感性方面的探討尚未被研究。所以，綜合以上研究，我們首先利用GEO數據庫[16]，發現食管癌組織中GTPBP4表達水平明顯高于正常對照組。為了證實這一現象，我們利用人食管黏膜上皮細胞系HEEC及食管癌細胞系EC9706、EC109和KYSE-150細胞系，檢測GTPBP4mRNA和蛋白表達水平，結果發現與正常食管黏膜上皮細胞HEEC相比，GTPBP4在食管鱗癌細胞系EC9706、EC109和KYSE-150中的表達明顯升高，并且EC109細胞中GTPBP4表達水平升高更為明顯，故以EC109細胞系作為下一步研究的對象。進一步，我們利用慢病毒載體LV-GTPBP4-siRNA感染EC109細胞，從而靶向沉默GTPBP4基因表達，采用RT-qPCR及Western blot實驗檢測基因沉默效果，結果發現沉默GTPBP4基因后，EC109細胞的中GTPBP4mRNA及蛋白表達水平均明顯下降，證實重組慢病毒可以有效沉默GTPBP4基因的表達。CCK8法及流式細胞術檢測結果顯示，沉默GTPBP4基因表達可有效抑制EC109細胞的生長，誘導細胞出現G1期阻滯，S期細胞明顯減少，從而抑制細胞的增殖，與文獻報道結果一致[17]。

化療是食管癌重要的輔助治療手段，然而在化療過程中，往往會出現化療不敏感或者化療緩解后復發[18-19]。因此，尋找化療抵抗時的生物學標志物和化療增敏劑、恢復耐藥腫瘤細胞的化療敏感性具有重要意義。目前臨床常用于食管癌化療的藥物是順鉑或氟尿嘧啶，本研究通過慢病毒感染食管癌EC109細胞并經化療藥物順鉑作用后觀察細胞生長和侵襲能力變化。CCK8法檢測細胞增殖及Transwell侵襲實驗結果顯示，沉默GTPBP4基因聯合順鉑或氟尿嘧啶使細胞的存活率及IC50顯著降低，明顯增加順鉑抑制食管癌細胞侵襲的能力，提示靶向沉默GTPBP4基因的siRNA和順鉑或氟尿嘧啶具有協同效應，能夠大大改善食管癌細胞EC109對化療藥物的敏感性。

既往研究發現，核糖體生物合成受損會影響細胞功能，導致細胞應激反應，而這種應激反應是通過核糖體-Mdm2-p53(ribosomal protein-Mdm2-p53,RP-Mdm2-p53)途徑，阻礙了Mdm2與p53結合，致使p53泛素化降解障礙，p53通路激活，細胞周期停滯、損傷修復、自噬等，在腫瘤發生過程中有重要作用[20-22]。另有研究發現，在具有野生型p53的乳腺癌個體中，GTPBP4蛋白表達增加與患者生存率降低相關，提示GTPBP4可能是促癌基因，且可能是通過抑制p53信號通路發揮抑制腫瘤細胞增殖的作用[17]。以上研究報道提示，GTPBP4可能是促癌基因，且可能是通過調節p53信號途徑來調節細胞周期，從而促進腫瘤細胞增殖、抑制凋亡而導致腫瘤的發生發展。但對于本實驗，該理論還需要我們進一步研究。

綜上所述，本研究結果表明GTPBP4基因在人食管鱗癌組織中高表達，LV-GTPBP4-siRNA慢病毒載體可有效沉默食管癌EC109細胞中GTPBP4基因的表達，從而抑制細胞增殖，降低其侵襲能力，增強人食管鱗癌細胞對化療藥物的敏感性。雖然其作用機制還不是很明確， 但該結果為GTPBP4在食管癌發生發展中的作用研究奠定了基礎，提供了假設，為探索GTPBP4在食管癌化療增敏及靶向治療方面提供了新思路。

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