川芎嗪聯合順鉑通過調控PI3K/AKT/mTOR通路對人肺癌A549細胞侵襲能力及線粒體功能的影響*

龐皓玥，胡凱文，孫滿強，周天

100029 北京，北京中醫藥大學 第二臨床醫學院(龐皓玥、孫滿強)；100078 北京，北京中醫藥大學東方醫院 腫瘤科(胡凱文、周天)

腫瘤轉移是癌癥致死的主要原因，如何有效抗轉移仍是臨床腫瘤治療難以攻克的關鍵問題。有研究發現，代謝模式變化在腫瘤轉移中必不可少[1]。癌細胞在有氧狀態下，糖酵解途徑供能增強，而有氧磷酸化供能比例下降，這種代謝模式可以通過保證缺氧條件下的供能、提供大量合成原料、形成酸性微環境抑制免疫等途徑[2]，為癌細胞的侵襲轉移創造有利條件。線粒體損傷是腫瘤代謝模式變化的基礎，如線粒體內酶表達異常、膜通透性改變、ROS生成異常等，均有助于腫瘤侵襲轉移[3]。因此，從能量代謝與線粒體損傷角度進行研究，對抑制腫瘤轉移侵襲能力具有重要意義。

長期以來，中醫活血化瘀法被廣泛應用于晚期癌癥患者的臨床治療中。川芎嗪(Tetramethylpyrazine,TMP)是經典活血化瘀藥川芎的主要成分，具有抑制多種腫瘤細胞增殖的藥理作用。順鉑(Cisplatin,DDP)是傳統化療藥物，經研究證實，TMP與DDP的聯合，可以增強對非小細胞肺癌的抑制作用[4-6]。本課題組前期研究表明，TMP聯合DDP可以調控Twist表達，從而抑制細胞增殖[7]，而PI3K/AKT/mTOR通路為Twist上游，是細胞能量代謝的關鍵調控因子。因此，本研究從能量代謝角度，探討TMP聯合DDP的抗腫瘤增殖與轉移機制。

1 材料與方法

1.1 細胞株及試劑

人肺腺癌A549細胞株購于上海蓋寧生物科技有限公司。TMP標準品購自上海源葉生物科技有限公司(貨號:B20203);DDP標準品購自上海源葉生物科技有限公司(貨號:B24462);JC-1試劑盒購于江蘇凱基生物技術有限公司(貨號:KGA602)。一抗：GAPDH monoclonal antibody、mTOR polyclonal Rabbit antibody、Phospho-mTOR(Ser2448) Rabbit Antibody、PI3K p85 Monoclonal antibody、AKT Monoclonal antibody購于Proteintech公司(貨號:60004-1-Ig、20657-1-AP、AF3308、60225-1-Ig、60203-2-Ig);二抗：Goat Anti-Rabbit IgG H+L、Goat Anti-Mouse IgG H+L購于中杉金橋公司(貨號:ZB-2301、ZB-2305)

1.2 細胞培養及分組

人肺腺癌A549細胞采用含10%胎牛血清、1%雙抗的DMEM(高糖)培養基于37℃、5%CO2培養箱中培養，每日觀察其生長情況，取對數生長期細胞用于實驗。將細胞分為空白對照組、DDP組、DDP聯合高、中、低劑量TMP組(DDP+TMP)。根據CCK-8實驗結果確定TMP高、中、低劑量藥物濃度，DDP藥物濃度通過查找相關文獻確定為2 μg/mL[8]，藥物處理時間24 h。

1.3 CCK-8法測定TMP對人肺腺癌A549細胞增殖的影響

以人肺腺癌A549細胞為測試細胞株，選用對數生長期的貼壁腫瘤細胞，用胰酶消化后，以含10%胎牛血清的完全培養基重懸細胞，調整細胞密度至5×104個/mL，將上述細胞懸液加入96孔板，每孔100 μL，37℃、5%CO2培養12 h后細胞貼壁。各實驗組孔分別加入16 mM、8 mM、4 mM、2 mM、1 mM、0.5 mM梯度濃度的TMP標準品，對照組不加入藥物，每組設置6個復孔，37℃、5%CO2培養24 h后進行增殖能力檢測。檢測時每孔加入CCK-8溶液10 μL，繼續置于細胞培養箱中1 h。采用酶標儀在450 nm波長處測定各孔OD值，計算各組抑制率。細胞增殖抑制率=[(對照組平均OD值-實驗組平均OD值)/(對照組平均OD值-空白組平均OD值)]×100%。根據實驗結果確定DDP+TMP高、中、低劑量組TMP的藥物濃度。

1.4 TMP聯合DDP對肺癌A549細胞形態的影響

取對數生長期的肺癌A549細胞，以5×105個/mL細胞/孔的密度接種于6孔板中，待細胞貼壁生長融合至75%以上時，按照分組加入DDP及不同濃度TMP處理細胞。將干預后的細胞置于37℃、5%CO2培養箱培養24 h后，倒置顯微鏡下(放大倍數為200倍)觀察細胞形態的變化并拍照。

1.5 Transwell小室實驗測定腫瘤細胞侵襲能力

在Transwell小室上室面加入100 μL用DMEM培養基稀釋的Matrigel(體積稀釋比例為1∶8)，下室面用移液槍頭涂抹Fibronectin(濃度0.5 mg/mL)，置于37℃培養箱中包被2 h，使Matrigel凝固成膠，4℃過夜風干。取對數生長期的A549細胞，加入DDP及TMP處理細胞，用藥干預24 h。接種細胞前拿出小室，吸出小室中殘余液體，每小室加入100 μL DMEM，37℃孵育30 min，水化基底膜。收集各組細胞，重懸于不含胎牛血清的DMEM培養液中，調整細胞濃度為5×104個/mL細胞。將各組細胞接種于Transwell小室的上室中，接種體積為200 μL(1×104個細胞)，下室中加入600 μL含10%胎牛血清的DMEM培養液。37℃、5% CO2培養24 h后取出小室，PBS洗2次，加入4%多聚甲醛，室溫固定15 min，PBS洗2次，用棉簽擦拭小室上室面未穿過小室膜的細胞，用結晶紫染色15 min后，在倒置顯微鏡(放大倍數為200倍)下觀察穿膜細胞數。實驗獨立重復2次。

1.6 透射電鏡觀察線粒體超微結構

取各組細胞消化，離心，制備成1×106個/mL細胞，棄上清，留下層細胞，加入3%戊二醛固定液固定2 h， 1%鋨酸固定1 h，逐級乙醇、丙酮脫水后, 環氧樹脂包埋, 超薄切片，經鈾、鉛雙重染色后，1200EX透射電鏡觀測各組細胞線粒體超微結構變化。

1.7 JC-1線粒體膜電位檢測試劑盒檢測線粒體膜電位

收集DDP及TMP干預后各組細胞量為1×106個/管, 用 PBS 洗滌細胞2次(離心2 000 r/min，5 min)，取100 μL 10× Incubation Buffer加900 μL滅菌去離子水稀釋成1×Incubation Buffer，混勻并預熱至37℃，吸取500 μL加入1 μL JC-10，渦旋混勻配成JC-10工作液，取500 μL JC-10工作液將細胞均勻懸浮，37℃，5%CO2的培養箱中孵育15～20 min；室溫離心(2 000 r/min，5min)收集細胞，用1×Incubation Buffer洗兩次；吸取500 μL 1×Incubation Buffer重新懸浮細胞；用流式細胞儀檢測(Ex=488 nm;Em=530 nm)線粒體膜電位，設未經處理的正常細胞為陰性對照組和陽性對照組，根椐陰性和陽性對照組的雙參數散點圖來設定門的位置。實驗獨立重復2次。

1.8 Western blot 檢測 PI3K、AKT、mTOR、p-mTOR的表達

取培養至對數生長期的A549細胞，調整細胞密度為5×105個/mL細胞接種于6孔板中，待細胞貼壁生長融合至75%以上時，加入DDP及相應濃度的TMP干預細胞，置于37℃、5%CO2培養箱培養24 h。各組細胞加入細胞裂解液(RIPA∶PMSF=100∶1)，用細胞刮刀刮下，收集至離心管，冰上裂解25 min后，12 000 r/min，4℃，離心10 min，取上清液為蛋白樣品，采用BCA蛋白濃度測定試劑盒檢測蛋白濃度，將蛋白樣品加入5×蛋白上樣緩沖液，置于100℃水浴中變性5 min。SDS-PAGE分離蛋白，根據目的蛋白的相對分子量配制相應的分離膠濃度(10%)。加樣后分別進行蛋白電泳、蛋白電轉移至PVE膜，5%脫脂奶粉常溫封閉1.5 h。將封閉后的膜按照目標蛋白所處位置進行剪切，分別加入對應的一抗PI3K(1∶1 000)、AKT(1∶1 000)、mTOR(1∶1 000)、p-mTOR(1∶1 000)，4℃反應過夜。TBST洗膜3次，5min/次；根據一抗的種屬選擇相應的二抗(Goat Anti-Rabbit IgG、Goat Anti-Mouse IgG，稀釋比例為1∶10 000)37℃孵育2 h。最后ECL發光、顯影、拍照。相對蛋白含量用各蛋白條帶灰度值/內參蛋白條帶的灰度值來表示。實驗獨立重復2次。

1.9 統計學方法

運用軟件SPSS 17.0 進行分析統計，計量資料采用均數±標準差表示。多組均數比較采用單因素分析，P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 TMP對人肺癌A549細胞增殖的影響，確定給藥濃度

CCK-8結果顯示，運用梯度濃度TMP干預肺癌A549細胞后，細胞增殖抑制率呈劑量依賴性，隨著TMP濃度升高，其增殖抑制率也增高。與對照組相比，TMP對A549肺癌細胞的抑制差異具有統計學意義(P<0.001)。取TMP干預肺癌A549細胞的近半數抑制濃度，確認TMP高、中、低給藥劑量分別為2 mM、1 mM、0.5 mM(表1)。

表1 CCK-8測定TMP對肺癌A549細胞增殖的抑制作用(N=6)

2.2 TMP+DDP對A549肺癌細胞形態的影響

各組細胞生長狀況良好，細胞呈細長梭形，細胞間排列緊密形成集落。實驗組細胞隨藥物濃度的增高數量減少，形態改變；其中DDP+TMP(2 mM)組、DDP+TMP(1 mM)組、DDP+TMP(0.5 mM)組細胞由具有較高侵襲能力的細長梭形變為侵襲能力較弱的圓形，細胞體積縮小，部分可見細胞核固縮，胞漿內可見顆粒和碎片，細胞生長明顯受到抑制(圖1)。

圖1 不同濃度TMP+DDP對于A549細胞形態的影響(×200)

2.3 TMP+DDP對A549細胞侵襲能力的影響

Transwell小室法檢測結果顯示，與對照組相比，各實驗組細胞均可使穿過鋪有人工基質 Matrigel 濾膜的細胞數量明顯降低，DDP+TMP(2mM)組細胞穿膜數量最低。隨著 TMP 濃度的增高，細胞侵襲數逐漸減少，侵襲抑制作用逐漸增強，且穿膜面細胞形態趨于圓形(圖2)。

圖2 不同濃度TMP+DDP對于A549細胞侵襲能力的影響(×200)

2.4 TMP+DDP對A549細胞線粒體結構的影響

運用透射電鏡觀察各組癌細胞線粒體結構可見，與對照組相比，應用 DDP 使細胞內出現大量空泡壞死，線粒體多呈圓形，雙層膜結構模糊，線粒體嵴數量較少，排列紊亂，肌節斷裂；聯合應用TMP后，細胞內線粒體形狀趨于橢圓形，且隨TMP劑量增高，線粒體形態更加飽滿，線粒體嵴數量較多，排列較清晰(圖3)。

圖3 電鏡觀察不同濃度TMP+DDP干預A549細胞線粒體結構(×30 000)

2.5 TMP+DDP對A549細胞線粒體膜電位的影響

JC-1法檢測線粒體膜電位顯示，與對照組相比，各組線粒體膜電位均顯著降低(P<0.05)，但DDP+TMP組線粒體膜電位較DDP組升高，且隨TMP濃度升高，線粒體膜電位有升高的趨勢，DDP+TMP(2mM)組較DDP組線粒體膜電位升高差異有統計學意義,P<0.05(圖4)。

圖4 不同濃度TMP+DDP干預A549細胞線粒體膜電位變化(JC-1)

2.6 TMP+DDP對A549細胞 PI3K、AKT、mTOR、p-mTOR蛋白表達的影響

Western blot檢測PI3K/AKT/mTOR通路蛋白,結果顯示(圖5)，與對照組相比，DDP組及DDP+TMP組均可下調PI3K、AKT、mTOR、p-mTOR蛋白表達(P<0.05)。DDP+TMP組在降低各蛋白表達方面優于單獨應用DDP組，且隨TMP濃度升高，各蛋白表達量呈現降低的趨勢。與DDP組相比，DDP+TMP(2mM)組可明顯下調PI3K、mTOR和p-mTOR蛋白表達(P<0.05)，DDP+TMP(1mM)組可下調mTOR、p-mTOR蛋白表達(P<0.05)。

圖5 DDP+TMP對A549細胞內PI3K/AKT/mTOR信號通路表達的影響

3 討 論

近年來，有關癌細胞能量代謝特征的研究受到越來越多重視，能量代謝重構被認為參與了癌癥的增殖、侵襲與轉移過程。早在1920s，科學家發現腫瘤細胞能量代謝的糖酵解途徑異常活躍，并認為其與線粒體損傷有關[9]。腫瘤細胞極活躍的代謝活動，造成周圍環境的乏氧狀態，而癌細胞線粒體功能受損，促進了糖酵解途徑供能，保證了腫瘤生長及轉移的能量需求[10]。線粒體功能受損還與腫瘤細胞抵抗凋亡、逃避免疫監督等有助于腫瘤轉移的特性密切相關[11]。這使靶向線粒體的治療手段成為近年來腫瘤治療領域的熱點。

中醫對癌癥常伴有血瘀狀態的認知，與腫瘤周圍低氧、酸性微環境的形成十分相似。研究表明，活血化瘀中藥可以通過抑制血管生成，改善乏氧微環境等機制，發揮抗腫瘤作用[12]。而癌細胞有氧糖酵解的能量代謝異常，增強了其對周圍環境的適應性。因此，我們推測中醫活血化瘀藥改善乏氧微環境狀態，從根本上改變了線粒體損傷的環境壓力，從而使線粒體有氧代謝的功能恢復，抑制糖酵解的發生，最終控制腫瘤生長轉移。研究顯示，活血化瘀中藥改善缺氧環境作用與PI3K/AKT/mTOR信號通路密切相關[13]。其中，AKT磷酸化后可降低線粒體ATP的消耗，使組織維持較低的線粒體膜電位，進而減少鈣離子進入線粒體和再灌注初期活性氧的生成[14]。因此，PI3K/AKT/mTOR通路很可能是活血化瘀中藥調節線粒體功能發揮抗腫瘤作用的關鍵機制。目前該研究思路還鮮有報道，值得深入挖掘。

TMP是傳統中醫活血藥川芎、當歸的主要成分，可以通過改善血液高凝狀態、抗腫瘤血管生成，改善乏氧微環境等方面抑制腫瘤細胞的增殖及轉移[15]。DDP是治療非小細胞肺癌常用的化療藥物，其通過阻礙腫瘤細胞DNA復制，從而抑制細胞的有絲分裂，雖然抗腫瘤效果明顯但毒性較強。TMP與DDP聯合使用，不僅能增強抗腫瘤效果，還能降低化療藥物引起的毒副作用，多項研究支持TMP聯合DDP在肺癌治療領域良好的應用前景[16-17]。本研究擬從改善腫瘤代謝角度，闡述DDP聯合TMP抑制肺癌細胞過程中TMP發揮的作用。

本研究首先通過CCK-8法確定TMP的用藥濃度，再觀察TMP聯合DDP對腫瘤細胞生長侵襲能力的影響。經TMP及DDP干預24 h后，顯微鏡下觀察肺癌A549細胞體積縮小，變為圓形，部分細胞內可見顆粒和碎片，細胞增殖速度減慢，與對照組形成較大差異。Transwell小室侵襲實驗顯示，各實驗組細胞穿膜數量均少于對照組(P<0.05)，且TMP聯合DDP對細胞穿膜的抑制明顯增強。以上結果說明TMP聯合DDP可以抑制A549細胞的生長及侵襲，且隨TMP劑量升高效用更加明顯。因此可以推測，TMP聯合DDP增強了對A549細胞增殖及侵襲能力的抑制作用，較單獨應用DDP效果更佳，且表現出劑量依賴性。

線粒體功能正常有賴于其結構的完整，已有的研究顯示，腫瘤細胞的線粒體普遍存在DNA突變，拷貝數變化、線粒體膜穩定性以及線粒體結構動態改變等結構異常，而線粒體功能隨之發生紊亂，并與實體腫瘤的發生發展密切相關[18]。如線粒體膜電位發生改變，增加抗凋亡蛋白的表達，延長腫瘤細胞壽命，減少轉移侵襲過程中的損耗[19]。本研究通過透射電鏡觀察各組細胞線粒體結構發現，單獨使用DDP后細胞主要發生空泡壞死，線粒體受損，表現為嵴數量較少且排列紊亂；聯合應用TMP后，線粒體形態更為飽滿，且形狀趨于橢圓形，可見排列清晰的嵴。這提示TMP可以降低線粒體損傷程度，使其發揮正常功能。同時，本研究還對線粒體膜電位進行了檢測，結果發現，與對照組相比，DDP及DDP+TMP組線粒體膜電位均顯著下降(P<0.05)，但聯合應用TMP使線粒體膜電位較單獨應用DDP有所升高，且隨TMP濃度升高，線粒體膜電位有升高的趨勢，其中，高劑量組線粒體膜電位升高較為明顯(P<0.05)。因此，我們推測TMP可以促進線粒體的正常功能，從而影響腫瘤細胞代謝。

PI3K/AKT通路是調控細胞能量代謝的經典通路，研究表明，其可以通過調節缺氧誘導因子HIF-1α表達，從而調控癌細胞的能量代謝模式，增加癌細胞對周圍乏氧環境的適應性[20]。mTOR是PI3K/AKT下游的關鍵激酶， PI3K/AKT/mTOR通路可以上調癌細胞糖酵解相關酶的活性，加強糖酵解過程[21]。另有一項三陰性乳腺癌細胞的研究顯示，AKT的激活可以調節癌細胞的線粒體代謝和氧化磷酸化[22]。本研究利用Western blot檢測肺癌A549細胞PI3K/AKT/mTOR信號通路的蛋白表達發現，TMP聯合DDP可使肺癌A549細胞內PI3K、AKT及mTOR蛋白表達均顯著降低(P<0.05)，TMP聯合DDP組對PI3K/AKT/mTOR通路的抑制作用要優于單獨應用DDP組，且呈濃度依賴性。同時，mTOR磷酸化修飾(p-mTOR)減少，即mTOR蛋白活性也受到了影響。這提示TMP聯合DDP增強了對PI3K/AKT/mTOR信號通路的抑制作用，與肺癌A549細胞的線粒體功能及能量代謝改變相關。

綜上所述，TMP聯合DDP能抑制腫瘤細胞增殖及侵襲能力，其機制可能通過調節PI3K/AKT/mTOR通路，改善線粒體功能，進而使癌細胞能量代謝模式發生改變，發揮聯合抗腫瘤作用。

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