NLRCs基因在乳腺癌中的表達和預后判斷中的價值*

禚映辰，張培國，張李婷，封衛(wèi)毅

710061西安，西安交通大學第一附屬醫(yī)院 藥學部(禚映辰、張李婷、封衛(wèi)毅); 255000山東 淄博,淄博市中心醫(yī)院 疼痛科(張培國)

乳腺癌是全世界婦女目前面臨的最為常見的癌癥。世界衛(wèi)生組織數(shù)據(jù)顯示，2018年全球約63萬人死于乳腺癌，新增病例209萬[1]。盡管在診斷和治療水平方面取得了很大的進步，但乳腺癌仍然是女性癌癥死亡的主要原因，約占女性癌癥死亡的25%[1]。因此，尋找乳腺癌預后判斷的潛在指標和藥物靶點具有重要的臨床意義。

越來越多的研究表明，腫瘤的發(fā)生和進展與免疫相關(guān)分子密切相關(guān)[2]。核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體家族[nucleotide-binding oligomerization domain(NOD)-like receptors,NLRs]是一類存在于胞質(zhì)中的模式識別受體，可分為5個亞家族：NLRA、NLRB、NLRC、NLRP和NLRX[3]。NLRs家族成員參與免疫和炎癥相關(guān)的程序識別，在調(diào)節(jié)病原體感染以及細胞損傷引起的炎癥反應方面起著重要作用[3]。其中NLRC家族共有五個成員，即NLRC1、NLRC2、NLRC3、NLRC4和NLRC5。研究表明，NLRCs大多為固有免疫細胞炎癥信號通路的調(diào)節(jié)劑[4]，但目前對于NLRCs在乳腺癌預后中的價值仍知之甚少。因此，本研究將利用學術(shù)界廣泛認可的生物信息數(shù)據(jù)平臺，深入研究NLRCs與乳腺癌特別是浸潤性乳腺癌的關(guān)系，探討其在乳腺癌診斷和預后評估中的價值，以期為進一步研究乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用機制提供有價值的佐證。

1 資料與方法

1.1 Oncomine 數(shù)據(jù)庫提取數(shù)據(jù)

Oncomine數(shù)據(jù)庫是一個在線癌基因芯片數(shù)據(jù)庫，包括715個數(shù)據(jù)集和86 733個樣本(www.oncomine.org)[5]。本研究中，設定的以下檢索條件：1)“gene：NLRC1”；2)“cancer type：breast cancer”；3)“data type：all”；4)“analysis type：cancervsnormal analysis”；5)“threshold by：P<0.05，fold change>2，gene rank=top 10%”。NLRC2、NLRC3、NLRC4和NLRC5基因依次按上述方法檢索。

1.2 TIMER數(shù)據(jù)庫進行生存分析

TIMER數(shù)據(jù)庫是系統(tǒng)性分析不同癌癥類型免疫細胞浸潤的在線數(shù)據(jù)庫(https://cistrome.shinyapps.io/timer/)。本研究中，應用Survival模塊探究基因表達和臨床結(jié)局之間的關(guān)系。

1.3 生物信息學數(shù)據(jù)庫提取數(shù)據(jù)

從UCSC-Xenc下載TCGA-BRCA數(shù)據(jù)集，篩選浸潤性乳腺癌NLRC3基因表達譜及患者的臨床信息數(shù)據(jù)(https://xenabrowser.net/)。以NLRCsmRNA表達水平中位數(shù)為界，將患者分為高表達組和低表達組，結(jié)合患者臨床病理參數(shù)，如性別、年齡、TNM分期和腫瘤分級，進行統(tǒng)計分析。

1.4 Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫進行生存分析

使用Kaplan-Meier Plotter在線數(shù)據(jù)庫的3 951個breast cancer數(shù)據(jù)集(http://kmplot.com/analysis/index.php?p=service)，分析5個NLRCs基因表達數(shù)據(jù)與患者生存時間的關(guān)系。本研究中，設定的以下檢索條件：1)“cancer：breast cancer”；2)“gene symbol：NLRC1”；3)“split patients by：median”；4)“survival： RFS ”或“OS”；由“follow up threshold：180 months”。NLRC2、NLRC3、NLRC4和NLRC5基因依次按上述方法檢索。無復發(fā)生存期(recurrence-free survival，RFS)、總生存期(overall survival，OS)。

1.5 統(tǒng)計學方法

本研究采用獨立樣本t檢驗比較乳腺癌組織與正常乳腺組織中NLRCsmRNA的表達量的差異；采用 Kaplan-Meier Plotter方法和Log-rank檢驗分析NLRCs表達與浸潤性乳腺癌預后的關(guān)系；采用GraphPad Prism 8軟件和χ2檢驗或Fisher確切概率法分析NLRC3表達與臨床病理特征的關(guān)系。P<0.05被認為具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 臨床常見腫瘤中NLRCs 的轉(zhuǎn)錄水平

Oncomine數(shù)據(jù)庫中共收集了1 514項關(guān)于NLRCs基因在不同類型癌組織和正常組織樣本中差異表達的研究數(shù)據(jù)(圖1)，表達差異有統(tǒng)計學意義的研究結(jié)果有91項，其中表達升高47項，表達降低44項。在乳腺癌中表達升高13項，表達降低2項。

圖1 NLRCs在不同腫瘤組織中mRNA的轉(zhuǎn)錄水平

2.2 NLRCs基因在乳腺癌和正常組織中的表達差異

對15項關(guān)于乳腺癌組織和乳腺正常組織NLRCs基因有差異表達的研究數(shù)據(jù)進行分析(表1)，發(fā)現(xiàn)乳腺癌患者的NLRC2mRNA表達水平在5項研究數(shù)據(jù)集中顯著上調(diào)(P<0.05)。在TCGA數(shù)據(jù)集中，浸潤性乳腺癌NLRC2mRNA的轉(zhuǎn)錄水平為正常組織的3.053倍，浸潤性小葉癌為2.165倍，浸潤性導管癌為2.655倍。在Curtis等[6]和Finak等[7]數(shù)據(jù)集中，乳腺髓樣癌和浸潤性乳腺癌NLRC2mRNA的轉(zhuǎn)錄水平分別為正常組織的2.192和3.692倍。

表1 NLRCs基因在乳腺癌組織和正常組織中的表達差異

乳腺癌患者的NLRC3mRNA表達水平在4項研究數(shù)據(jù)集中顯著上調(diào)(P<0.05)。在Gluck等[8]數(shù)據(jù)集中，浸潤性乳腺癌NLRC3mRNA的轉(zhuǎn)錄水平為正常組織的2.750倍；在Turashvili等[9]數(shù)據(jù)集中，浸潤性小葉癌和浸潤性導管癌NLRC3mRNA的轉(zhuǎn)錄水平分別為正常組織的2.110和4.351倍；在Radvanyi等[10]數(shù)據(jù)集中，浸潤性導管癌NLRC3mRNA的轉(zhuǎn)錄分別為正常組織的2.193倍。

NLRC4mRNA表達在1項數(shù)據(jù)集中明顯地上調(diào)，而在2項數(shù)據(jù)集中顯著下調(diào)(P<0.05)。在Radvanyi等[10]數(shù)據(jù)集中，浸潤性導管癌NLRC4mRNA的表達既表現(xiàn)為上調(diào)又表現(xiàn)為下調(diào)，而正常組織中NLRC4mRNA的表達是浸潤性小葉癌的5.390倍。

NLRC5mRNA表達水平在3項研究數(shù)據(jù)集中顯著上調(diào)(P<0.05)。在Ma等[11]數(shù)據(jù)集中，乳腺導管原位癌和浸潤性導管癌NLRC5mRNA的轉(zhuǎn)錄水平分別為正常組織的3.130和2.231倍；在Karnoub[12]數(shù)據(jù)集中，浸潤性導管癌NLRC5mRNA的轉(zhuǎn)錄水平為正常組織的2.504倍。

2.3 NLRCs在浸潤性乳腺癌(非特殊型)中的表達

乳腺癌病理分型眾多，NLRCs基因?qū)Σ煌中腿橄侔┑挠绊懘嬗胁町悺榱耸寡芯扛泳哂嗅槍π裕覀儗⒁越櫺匀橄侔?非特殊型，約占整個乳腺癌的80%～90%)為研究對象，進一步細化研究。通過對Oncomine數(shù)據(jù)挖掘，發(fā)現(xiàn)共有15項關(guān)于NLRCs在浸潤性乳腺癌與正常組織中的表達差異分析的研究，整合這15項的研究結(jié)果顯示(圖2)，NLRC2/3/4/5在浸潤性乳腺癌中表達量顯著高于正常組織(P<0.05)；NLRC1在浸潤性乳腺癌中的表達與正常組織差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

圖2 NLRCs在浸潤性乳腺癌中mRNA的轉(zhuǎn)錄水平

2.4 NLRCs基因表達與浸潤性乳腺癌患者生存預后的關(guān)系

對1 099例TCGA數(shù)據(jù)集中浸潤性乳腺癌RNA-seq數(shù)據(jù)進行分析，如圖3所示,高NLRC3表達與浸潤性乳腺癌較好的預后相關(guān)(Log-rankP=0.028)，即NLRC3高表達延長浸潤性乳腺癌患者的OS，而乳腺癌組織NLRC1/2/4/5的表達與患者預后無關(guān)(Log-rankP>0.05)。提示NLRC3的表達與浸潤性乳腺癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。

圖3 NLRCs表達水平與浸潤性乳腺癌患者OS的關(guān)系

2.5 NLRC3 mRNA水平與浸潤性乳腺癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系

對1 143例TCGA數(shù)據(jù)集中浸潤性乳腺癌RNA-seq數(shù)據(jù)并結(jié)合臨床病理參數(shù)進行分析，如表2所示，浸潤性乳腺癌組織中NLRC3表達與T分期(P=0.011)和腫瘤分級(P=0.040)顯著性相關(guān)，與性別(P=0.081)、年齡(P=0.443)、淋巴結(jié)受累程度和范圍(P=0.393)以及遠處轉(zhuǎn)移(P=0.052)無關(guān)。同時我們還觀察到，NLRC3高表達組浸潤性乳腺癌患者的臨床病理特征明顯優(yōu)于低表達組的患者，因此NLRC3與浸潤性乳腺癌的惡性程度密切相關(guān)。

表2 NLRC3與浸潤性乳腺癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系

2.6 不同分子亞型中乳腺癌NLRC3 mRNA表達的預后價值

基因組分析可將乳腺癌分為4個分子亞型，luminal A型、luminal B型、人表皮生長因子受體2(human epidermal growth factor receptor 2,HER2)過表達型和基底細胞樣(basal-like)型。通過Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫獲取了3 951例乳腺癌患者的生存數(shù)據(jù)，分析NLRC3基因在乳腺癌不同分子亞型中的表達對患者RFS和OS的影響(圖4)，分析發(fā)現(xiàn)NLRC3高轉(zhuǎn)錄組與低轉(zhuǎn)錄組相比，4種分子亞型患者RFS和basal-like型患者OS均顯著延長(P<0.05)。

圖4 NLRC3基因表達與不同分子亞型乳腺癌患者RFS或OS的關(guān)系

3 討 論

NLRCs是一類感應病毒入侵和機體自身細胞損傷(或應激)的先天免疫“傳感器”[13]。 近年來，NLRCs在影響癌癥生物學過程中的作用正受到關(guān)注。例如，NLRC1和NLRC2可直接調(diào)節(jié)NF-κB和MAPK促炎途徑，影響腫瘤細胞的增殖、凋亡、遷移和血管生成[14]；NLRC3通過抑制PI3K-mTOR信號通路的激活阻斷結(jié)腸腫瘤的生成[15]；NLRC4對癌癥的進展具有雙重調(diào)控作用[16]；NLRC5與直腸癌、宮頸癌、膀胱癌、黑色素瘤和頭頸癌的患者生存預后高度相關(guān)[17]。然而，NLRCs對乳腺癌的進一步生物信息學分析尚未完成。

鑒于此，本研究分析已收錄在Oncomine中人乳腺癌組織NLRCs基因的轉(zhuǎn)錄水平，發(fā)現(xiàn)在乳腺癌中有13項研究數(shù)據(jù)顯示NLRCs基因轉(zhuǎn)錄水平明顯上調(diào)，2項顯著下調(diào)，提示NLRCs的表達可能與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。然而，乳腺癌的組織學分型很多，不同分型存在病理特征上的差異，為此本研究主要探討5個NLRC分子在最常見的乳腺癌類型—非特殊型浸潤性乳腺癌中mRNA表達及其預后價值。研究結(jié)果顯示NLRC1在浸潤性乳腺癌中的表達與正常組織差異無統(tǒng)計學意義；NLRC2/3/4/5在浸潤性乳腺癌中表達量顯著高于正常組織。然而，浸潤性乳腺癌患者預后僅與NLRC3的表達呈正相關(guān)，與NLRC1/2/4/5的表達無關(guān)，這表明NLRC3可能在浸潤性乳腺癌中發(fā)揮抑癌作用。進一步亞組分析顯示NLRC3高表達組浸潤性乳腺癌患者的臨床病理特征明顯優(yōu)于低表達組的患者。因此，NLRC3有望成為浸潤性乳腺癌潛在的診斷和預測癌癥患者生存預后的重要生物標志物。今后擬開展實驗性研究，為NLRC3成為浸潤性乳腺癌治療靶點提供實驗依據(jù)。

浸潤性乳腺癌是一類異質(zhì)性極強的腫瘤，通常情況下，相同組織學分型的乳腺癌可能表現(xiàn)為不同的分子病理特征。如果只參照癌癥的組織學分型和臨床病理參數(shù)則不足以預測乳腺癌病理生理學的真實行為，多數(shù)研究更側(cè)重于分析乳腺癌的分子模式[18]。基于基因表達譜，Perou，Sorlie等將乳腺癌分為4種臨床相關(guān)分子亞型：luminal A型、luminal B型、HER2過表達型和basal-like型[19]。

由于大約80%的乳腺癌在組織學上被歸類為浸潤性導管癌，其次是浸潤性小葉癌(約占病例的10%～15%)，因此NLRC3對不同分子亞型乳腺癌的預后價值，基本可以認為是NLRC3對不同分子亞型浸潤性乳腺癌的預后價值。分析結(jié)果顯示NLRC3對4種亞型乳腺癌患者的預后均起積極作用，其中分子型為basal-like型的NLRC3高表達組患者RFS和OS均顯著延長。因此，高NLRC3表達似乎極大改善了basal-like表型乳腺癌患者的預后。

綜上所述，本研究采用國際廣泛認可的數(shù)據(jù)庫系統(tǒng)性地分析了NLRC家族成員在乳腺癌中的表達和預后價值，并對不同亞型乳腺癌進行深入分析，結(jié)合本研究可以推測，NLRC3可能是浸潤性乳腺癌的抑癌基因(特別是basal-like分型)，有望成為有價值的患者預后評估新型生物標志物，但其具體機制仍有待進一步闡明。

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