我國部分地區羊駝十二指腸賈第蟲的PCR 檢測和鑒定

黃玫瑰，張齊元，汪 文，2，徐春艷，侯旻昱，王 甜，井 波*

（1.塔里木大學動物科學學院，新疆生產建設兵團塔里木動物疫病診斷與防控工程實驗室新疆阿拉爾 843300；2.阿克蘇職業技術學院，新疆阿克蘇 843000）

十二指腸賈第蟲（Giardia duodenalis）是人和動物常見的人獸共患腸道寄生原蟲，宿主范圍廣泛[1]。家畜、寵物和野生動物等動物糞便中的十二指腸賈第蟲包囊常污染水源和食物，導致人畜賈第蟲病的暴發和流行[2]。基于遺傳進化研究，十二指腸賈第蟲至少分化為8個（A-H）集聚體，集聚體A 和B 是人獸共患集聚體，主要感染人和多種動物，而其他集聚體則多存在宿主特異性[1,3]。我國自2002 年首次從澳大利亞引種羊駝，隨后建立多個基地進行繁育和推廣，用于毛紡業、觀光業和旅游業的發展，甚至部分作為寵物，與人接觸密切[4]。1987 年，在美國威斯康星州首次報道大羊駝感染十二指腸賈第蟲，隨后陸續在美國、秘魯和澳大利亞等國家均有美洲駝感染十二指腸賈第蟲的報道[5-8]，而我國有關羊駝感染十二指腸賈第蟲的研究資料較少。本試驗采用PCR 法檢測我國不同地區羊駝的感染情況和鑒定基因型，以期為羊駝賈第蟲病防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

分別于2016 年8 月至2017 年7 月和2019 年7 至8 月收集塔城市、溫宿縣、和靜縣、青河縣、尼勒克縣、青島市、繁峙縣、代縣和陽曲縣養殖基地的羊駝糞便（20～30 g）樣本484份，帶回實驗室置于4 ℃冷藏箱保存。羊駝多數為成年母駝，采集樣本時均未見腹瀉。

1.2 DNA提取

每份糞便樣本在自封袋內充分揉勻后，分別用一次性筷子挑取約300 mg，置于潔凈的2 mL 離心管內，使用糞便全基因組DNA 提取試劑盒（E.Z.N.A.?D4015-02，美國OMEGA Bio-Tek 公司生產），按照說明書步驟操作提取200 μL DNA，置-20 ℃保存。

1.3 PCR擴增

參考Appelbee 等[9]的十二指腸賈第蟲小亞基核糖體RNA（SSU rRNA）基因引物序列。引物由蘇州金維智生物科技有限公司合成。其中，第一輪上游序列為5'-AAGTGTGGTGCAGACGGACTC-3'，下游序列為5'-CTGCTGCCGTCCTTGGATGT-3'，目的片段為497 bp；第二輪上游序列為5'-CATCCGGTCGATCCTGCC-3'，下游序列為5'-AGTCGAACCCTGATTCTCCGCCAGG-3'，目的片段為299 bp。PCR反應體系25 μL：模板DNA 1 μL、10×Buffer 2.5 μL、dNTPs 2 μL、rTaq酶0.15 μL、上下游引物（20 μmol/L）各0.3 μL、二甲基亞砜（DMSO）1.25 μL、雙蒸水17.5 μL。第一輪和第二輪的退火溫度分別為55 ℃和59 ℃。PCR反應結束后，取5 μLPCR產物于1.5%的瓊脂糖凝膠中進行電泳，凝膠成像系統中檢查結果。

1.4 測序與序列分析

PCR 擴增出目的片段的產物，委托蘇州金維智生物科技有限公司進行雙向測序。將測定序列進行拼接，在NCBI數據庫中進行BLAST 搜索，應用Clustal X 2.11軟件對所獲序列進行比對分析，鑒定十二指腸賈第蟲集聚體。

2 結果與分析

2.1 羊駝十二指腸賈第蟲感染情況（見圖1、表1）

圖1 十二指腸賈第蟲SSU rRNA基因的PCR擴增Fig.1 PCR amplication based on SSU rRNA gene of G.duodenalis

由圖1、表1 可知，對484 份羊駝糞便樣本DNA 進行PCR 擴增，有8 份擴增出目的片段條帶，十二指腸賈第蟲總感染率為1.7%。9個養殖基地中，溫宿縣、和靜縣、青河縣、尼勒克縣、代縣和陽曲縣羊駝十二指腸賈第蟲感染率分別為3.0%、5.0%、2.9%、8.3%、2.6%和0.5%；而塔城市、青島市和繁峙縣的羊駝均未發現十二指腸賈第蟲感染。

表1 我國不同地區羊駝十二指腸賈第蟲感染情況Tab.1 Infection of G.duodenalis in alpaca in different collection sites in China

2.2 十二指腸賈第蟲集聚體鑒定

擴增出的8 個十二指腸賈第蟲陽性樣本均成功雙向測序，序列比對分析結果表明，5 條序列與我國馬源十二指腸賈第蟲集聚體A（序列登錄號：MN174121）同源性為100%，鑒定為集聚體A；3 條序列與我國猴源十二指腸賈第蟲集聚體B（KJ888984）同源性為100%，鑒定為集聚體B；8 個樣本均為人獸共患集聚體。

3 討論

2008 年，Trout 等[6]對美國馬里蘭州的羊駝十二指腸賈第蟲感染情況進行調查，發現感染率為4.9%。Gomez-Puerta等[5]和Gómez-Couso等[7]分別于2012年和2014年對秘魯羊駝的十二指腸賈第蟲感染情況進行調查，發現感染率較高，分別為13.0%和50.0%。2018 年，Koehler 等[8]報道澳大利亞不同羊駝群的十二指腸賈第蟲的感染率為7.4%。本次調查發現，我國羊駝十二指腸賈第蟲感染率為1.7%，低于秘魯、美國馬里蘭州和澳大利亞等地羊駝十二指腸賈第蟲的感染率，可能與調查中的樣本多來自成年羊駝有關。在秘魯的一項調查顯示，小于1月齡羊駝和成年羊駝的感染率分別為33.3%和1.8%，存在顯著的年齡差異[5]。目前，我國多數羊駝養殖基地多是引種、擴繁和銷售模式，幼齡羊駝在基地中相對較少。在今后的調查中，應加強對幼齡羊駝的調查。

十二指腸賈第蟲的8種集聚體（A-H）中，集聚體A和集聚體B為人獸共患集聚體，具有廣泛的宿主，可通過污染水源感染人和動物[1-2]。在馬里蘭州的調查顯示，3份羊駝陽性十二指腸賈第蟲樣本均為集聚體A[5]；在秘魯的調查顯示，46 份羊駝羊駝陽性十二指腸賈第蟲樣本37 份為集聚體A，9份為集聚體E[6]。在秘魯的另一項調查顯示，基于2個基因位點，對137個羊駝十二指腸賈第蟲顯微鏡鏡檢陽性樣本進行PCR 擴增，成功獲得92 條序列，其中，67 條為集聚體A，24 條為集聚體E，1 條為集聚體A 和E 混合感染[7]。在澳大利亞的調查顯示，6 份羊駝羊駝陽性十二指腸賈第蟲樣本5份為集聚體A，1份為集聚體E。本次調查發現，我國不同地區羊駝感染的十二指腸賈第蟲以集聚體A 為優勢集聚體，與上述報道的調查結果相一致；同時發現羊駝可感染集聚體B，是否還感染其他集聚體有待于進一步調查研究。

4 結論

調查結果顯示，我國部分地區羊駝十二指腸賈第蟲感染率較低，存在人獸共患集聚體A 和集聚體B，提示具有潛在的人獸共患風險。