新疆南疆部分地區綿羊的綿羊無漿體病感染情況調查

林留霞，桂成坤，李蓮瑞，2*

（1.塔里木大學動物科學學院，新疆阿拉爾 843300；2.塔里木畜牧科技兵團重點實驗室，新疆阿拉爾 843300）

綿羊無漿體病是在綿羊和山羊體內由專性寄生的蜱傳性的血液傳染病，舊稱邊蟲病[1-2]，廣泛存在于熱帶和亞熱帶地區，溫帶地區也有少量分布[3]。1983年，馬玉良等[4]首次在新疆發現綿羊無漿體感染，隨后遼寧、內蒙古、甘肅、陜西、寧夏、青海、河南、山東、四川等地區[5-9]相繼出現綿羊無漿體的報道。該病主要破壞動物的紅細胞，綿羊感染該病后出現消瘦、貧血、黃疸等臨床癥狀，造成生長發育緩慢、料重比增高、急性感染時甚至會導致動物死亡[10]。目前，基層地區檢測綿羊無漿體病的主要方法有吉姆薩染色法，但吉姆薩染色法只能在動物感染后16～22 d 檢出蟲體，檢出率低。因此，本試驗采用巢式PCR 法，通過MSP4基因和16S rRNA 基因設計并合成引物，進行無漿體病感病率檢測，并對數據進行統計分析，進行流行病學調查，進而為南疆地區綿羊無漿體病的防控工作提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

對南疆4個地區637只綿羊進行一次性無菌頸靜脈采血并編號，保存于4 ℃恒溫箱中備用。陽性樣品由河南農業大學獸醫寄生蟲學實驗室饋贈。南疆4地區采樣地點分布及采樣數量見表1。

1.2 試驗試劑與儀器

試劑：Gold view 染料購自蘇區金唯智生物科技有限公司；d NTP Mixture 購自北京全式金生物技術有限公司；DL2000 Marker購自北京華大生物科技有限公司；Agarose購自北京沃比森科技有限公司；全血DNA 快速提取試劑盒購自北京華大生物科技有限公司。

儀器：SW-CJ-2F 凈化工作臺（上海博訊實業有限公司醫療設備廠）、5415R 小型臺式高速冷凍離心機（Eppendorf 公司）、Vortex Geni2 渦旋混合器（Sciectific Industries 公司）、HVE-50 高壓滅菌鍋（HIPAYAMA 公司）、Mini-PROTEAN Tetra 電泳槽（北京六一儀器廠）、GEL DOC XR+凝膠成像系統（美國BIO-RAD 公司），TProfessional PCR擴增儀（德國Biometra公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 綿羊全血DNA的提取和巢式PCR擴增

按北京華大生物科技有限公司生產的全血DNA快速提取試劑盒說明書提取羊全血DNA。參照王貴強[11]設計的引物序列進行試驗。其中，特異性引物由北京華大基因公司合成。羊無漿體引物序列見表2。

表1 綿羊血液樣品統計表Tab.1 Sheep blood sample statistics table

表2 綿羊無漿體引物序列Tab.2 Anaplasma ovis primer sequence

巢式PCR 反應體系為：DNA 模板1 μL、上游引物AO1/AO3 和下游引物AO2/AO4 各0.3 μL、dNTP Mixture 12.5 μL、加入10.9 μLddH2O 補足至25 μL 體系。第1 輪PCR擴增程序為：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，進行25個循環；72 ℃延伸反應10 min。第2輪PCR擴增程序預變性、變性、退火及延伸等后續步驟與第1 輪PCR 程序相同（變性至延伸過程重復35個循環）。

1.3.2 巢式PCR產物檢測

綿羊無漿體巢式PCR 產物檢測是將第1 套引物擴增的產物稀釋20倍，取1 μL作第2套引物擴增的模板，進行擴增。擴增后對PCR 結果進行1%Agrose 電泳進行檢測。

1.3.3 感染情況統計

巢式PCR擴增出目的條帶584 bp的樣品為陽性樣品，表示綿羊感染綿羊無漿體，統計4個地區綿羊無漿體感染情況。

2 結果與分析

2.1 巢式PCR檢測結果（見圖1）

將綿羊無漿體（A.ovis）PCR 擴增結果進行電泳，得到22 份樣品的PCR 1%Agrose 電泳檢測結果。由圖1 可知，本試驗得到的綿羊無漿體的目的條帶大小為584 bp，PCR結果與理論分子量一致。注：M 為DL2000；N 為陰性對照；P為陽性對照；1～22為部分樣品A.ovis檢測結果。

2.2 感染情況統計結果（見表3、圖2、圖3）

由表3可知，喀什地區的巴楚縣感染率高達91.4%，是21個縣市中最高的，與于心等[12]對塔里木盆地地區蜱的分布情況相吻合，調查結果顯示巴楚地區亞東璃眼蜱、短小扇頭蜱和銀盾革蜱均有分布且是優勢種，優勢蜱的廣泛分布加劇了綿羊無漿體的分布。根據卡方檢驗，南疆4個地區的平均感染率差異極顯著（χ2=26.914，P＜0.001）。巴州地區總體感染率為75.8%，是感染率最高的地區，與張玉婷等[13]調查巴州地區羊體表寄生的優勢種革蜱情況相符。其余3地州各地區綿羊感染綿羊無漿體情況雖有不同但差距不大。

圖1 綿羊全血部分樣品的綿羊無漿體PCR檢測結果Fig.1 Anaplasma ovis PCR detection results of some samples of sheep whole blood

表3 南疆4地區無漿體病感染率Tab.3 Infection rate of Anaplasma ovis in four areas of southern Xinjiang

圖2 南疆4地區無漿體病感染率誤差圖Fig.2 Error map of Anaplasma ovis infection rate in four areas of Southern Xinjiang

圖3 南疆4地區無漿體病感染率Fig.3 Infection rate of Anaplasma ovis infection rate in four areas of Southern Xinjiang

由圖2 可知，南疆4 地區各縣市無漿體感染率在11.4%～91.4%范圍內，其中阿克蘇地區和和田地區感染率略低于南疆四地區平均值；喀什地區則略高于平均值；巴區地區明顯高于4地區感染率平均值；各地區差異較大。

由圖3 可知，南疆4 地區無漿體病感染率由高到低為巴區地區、喀什地區、和田地區、阿克蘇地區，其中和田與阿克蘇地區感染率較為接近，同為南疆四地區較低水平；喀什地區各縣市無漿體病感染率差異最大，感染率最低的喀什市，最高的是巴楚縣，相差7.3倍。

3 討論

無漿體病（anaplasmosis）的傳播途徑包括生物性傳播、機械性傳播和胎盤傳播，其中蜱的生物性傳播是最主要最有效的傳播方式[14]。1990年，呂文順等[15]通過傳播試驗確定亞東璃眼蜱、草原革蜱和短小扇頭蜱是傳播綿羊無漿體的媒介蜱。2018年，聞秀秀等[16]通過PCR檢測和同源性分析確定銀盾革蜱和邊緣革蜱也是綿羊無漿體的媒介蜱。代艷艷等[17]對南疆地區牛羊蜱的調查結果顯示，扇頭蜱屬和璃眼蜱屬是南疆地區的優勢蜱屬，且南疆各地均有分布。因此，綿羊無漿體的感染情況和分布情況與蜱的分布直接相關，與本次調查結果相符。

曲久等[18]調查西藏西北羌塘草原部分地區山羊的綿羊無漿體感染率為10.4%。張文靜等[19]對中國陜西、云南、河南共12個縣區奶山羊血液樣品進行檢測，綿羊無漿體總陽性率為23.0%。Liu 等[20]對我國中南部綿羊無漿體進行流行病學調查，感病率為73.9%。孫明等[21]對甘肅省景泰縣羊無漿體病感染率進行調查，感病率為30.6%。黃毓蘭等[22]對云南省種羊繁育推廣中心羊只進行無漿體檢測的感病率達44.4%。南疆4 地區無漿體病平均感病率為33.3%，處于中國中間水平。上述研究表明，綿羊無漿體病感病率差異性較大，與飼養方式、飼養環境等因素關聯性較大。

近年來，南疆地區畜牧業迅速發展，但飼養方式落后，多為“放牧+補飼”和“放牧+舍飼”[23]。在野外放牧條件下羊群易被蜱叮咬，這種落后的飼養方式造成南疆地區綿羊無漿體病的廣泛分布。該病可致病羊日漸消瘦、生產性能下降，混合感染或繼發感染更會導致死亡率增加[22]，嚴重影響綿羊養殖業的發展。該病的防治應防重于治，即控制媒介蜱。可采取輪換放牧和藥物滅蜱聯合進行達到控蜱滅蜱的目的。同時，應改變傳統的放牧模式，集中科學飼養。

4 結論

本試驗發現，巴區、喀什、和田和阿克蘇地區的感染率分別為75.8%、34.8%、23.3% 和23.0%，平均感染率為33.3%，說明新疆南疆地區屬于綿羊無漿體病高發地區需要加大防控力度。