耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌耐藥監(jiān)測(cè)及分子耐藥機(jī)制的研究進(jìn)展

梁武華，梁敏煜，周海燕，吳耀勛

（1.玉林市婦幼保健院新生兒科，廣西 玉林 537000；2.吉林醫(yī)藥學(xué)院，吉林 吉林 132000）

肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumonia，KP）為腸桿菌屬，是社區(qū)和醫(yī)院獲得性感染的常見(jiàn)致病菌，可導(dǎo)致呼吸道、消化道、皮膚、泌尿道、血液等部位感染。根據(jù)中國(guó)CHINET網(wǎng)2018年監(jiān)測(cè)[1]，該菌在臨床分離的腸桿科細(xì)菌中，已經(jīng)超越大腸桿菌成為第一位的致病菌。碳青霉烯類抗生素是治療肺炎克雷伯菌感染最有效的藥物。但隨著抗生素的泛用和濫用，耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌（carbapenem-resistant Klebsiella pneumonia，CRKP）菌株不斷出現(xiàn)和傳播[2-4]，成為全球關(guān)注的公共衛(wèi)生問(wèn)題。2017年WHO將CRKP列為21世紀(jì)最重要的耐藥病原菌之一[5]，給感染控制帶來(lái)巨大挑戰(zhàn)。如何加強(qiáng)CRKP的耐藥性監(jiān)測(cè)和流行病學(xué)研究，探究CRKP產(chǎn)生耐藥的分子機(jī)制，分析耐藥規(guī)律和特點(diǎn)，控制多重耐藥菌的傳播擴(kuò)散，指導(dǎo)臨床合理抗感染治療，成為目前的研究熱點(diǎn)。本文就CRKP耐藥監(jiān)測(cè)和分子耐藥機(jī)制的研究進(jìn)展做一綜述。

1 CRKP耐藥監(jiān)測(cè)

1.1 CRKP感染流行現(xiàn)狀 2001年Yigit等[6]首先在美國(guó)北卡羅萊那州醫(yī)院發(fā)現(xiàn)第一株CRKP，此后CRKP在世界各國(guó)陸續(xù)被報(bào)道[7-9]。2007年Wei等[10]在我國(guó)浙江省最早分離出CRKP的菌株。2008年在印度發(fā)現(xiàn)對(duì)包括碳青霉烯類在內(nèi)的所有β內(nèi)酯胺類抗生素耐藥的“超級(jí)細(xì)菌”[11]，引起全球廣泛關(guān)注。

近年來(lái)我國(guó)臨床分離的肺炎克雷伯菌中CRKP陽(yáng)性率大幅度增加。王娜等[12]調(diào)查某醫(yī)院6年間CRKP的分布及變遷情況，結(jié)果顯示，CRKP檢出率由2012年的0.4%上升至2017年的29.5%；重癥監(jiān)護(hù)病房（ICU）CRKP的分離率明顯高于普通病房。吳方強(qiáng)等[13]報(bào)道：安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院從4 830份感染者標(biāo)本中檢出CRKP 690株，占14.29%，2018年CRKP分離率為16.67%，高于2014年的12.98%；中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院2013年至2017年病原菌分布及藥敏分析結(jié)果顯示[14]，醫(yī)院共從標(biāo)本中分離出4 946株KP，其中710株為CRKP，占14.4%，且醫(yī)院CRKP由2013年的3.2%增至2017年的29.3%。趙建平等[15]對(duì)某三甲醫(yī)院2011年至2018年CRKP的分離情況和耐藥現(xiàn)狀進(jìn)行分析，CRKP檢出率由2011年的0上升到2018的26.5%，增長(zhǎng)趨勢(shì)明顯；2018年全國(guó)細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)網(wǎng)（CARSS）監(jiān)測(cè)結(jié)果顯示[16]，2013年，CRKP菌株的檢出率為4.9%，2018年已上升至10.1%，各省分布有差異，全國(guó)CRKP檢出率最高的地區(qū)是河南省、上海市及北京市，其中河南省上升幅度最大，較2017年25.9%上升至32.5%。面對(duì)CRKP檢出率持續(xù)增加的嚴(yán)峻形勢(shì)，臨床需引起高度重視，應(yīng)給予更多的關(guān)注，加強(qiáng)對(duì)CRKP的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)和主動(dòng)監(jiān)測(cè)。

CRKP引起院內(nèi)感染暴發(fā)流行事件屢有發(fā)生，在英國(guó)、中東地區(qū)、我國(guó)山東省等地均曾被報(bào)道過(guò)[17-19]。NICU是肺炎克雷伯菌感染的高發(fā)區(qū)，近年來(lái)不斷出現(xiàn)CRKP在新生兒病房暴發(fā)流行[20-21]。賈楠等[22]曾報(bào)道5株攜帶NDM-1基因及其他多重耐藥基因的“超級(jí)細(xì)菌”引起新生兒病房醫(yī)院感染的聚集暴發(fā)。提示由CRKP引起的感染和暴發(fā)已成為非常棘手的嚴(yán)重問(wèn)題，應(yīng)加強(qiáng)碳青霉烯類抗菌藥物應(yīng)用的管理及醫(yī)院感染的防控手段，避免耐藥細(xì)菌的暴發(fā)和流行。

1.2 CRKP耐藥現(xiàn)狀 21世紀(jì)初，碳青霉烯類抗生素對(duì)肺炎克雷伯菌的敏感性為100%[23]。近年來(lái)，隨著CRKP的出現(xiàn)，檢出率不斷上升，耐藥率呈持續(xù)升高趨勢(shì)。意大利的一項(xiàng)研究[24]顯示，在檢出的131株肺炎克雷伯菌菌株中，對(duì)至少一種碳青霉烯類具有耐藥性的有42株（占32.1%）；Liapis E等[25]對(duì)法國(guó)21家醫(yī)院產(chǎn)KPC酶的53棵菌株研究發(fā)現(xiàn)：95%的菌株對(duì)厄他培南不敏感；在國(guó)內(nèi)，張凡等[26]調(diào)查我國(guó)2009年至2016年耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌的藥物敏顯示：193株CRKP對(duì)9種抗菌藥物耐藥率均高于65%，其中對(duì)亞胺培南從53.3%上升至91.5%，對(duì)美羅培南從40.0%上升至90.2%，總耐藥率分別為77.2%和80.8%，耐藥形勢(shì)嚴(yán)重。歐陽(yáng)娜等[27]回顧分析2009年至2018年10年間10 075株KP，結(jié)果顯示，KP對(duì)碳青霉烯類抗生素的耐藥率呈逐年快速上升的趨勢(shì)，對(duì)亞胺培南的耐藥率從0.6%上升至34.3%；對(duì)美羅培南的耐藥率從1.5%上升至32.7%。2018年歐洲抗菌素耐藥性監(jiān)測(cè)網(wǎng)（EARS-Net）最新數(shù)據(jù)提示[28]：2018年肺炎克雷伯菌對(duì)亞胺培南的耐藥性為26.6%，對(duì)美羅培南的耐藥性為17.6%。2018年中國(guó)CHINET網(wǎng)的細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)結(jié)果顯示[1]，肺炎克雷伯菌對(duì)亞胺培南和美羅培南的耐藥率分別從2005年的3.0%和2.9%上升至2018年的25.0%和26.3%，耐藥率上升幅度高達(dá)8倍多。值得關(guān)注的是，5所兒童醫(yī)院（含婦幼保健院）中除1所醫(yī)院分離的肺炎克雷伯菌對(duì)亞胺培南的耐藥率為2.5%外，其余4所的耐藥率范圍為32.1%～45.5%，提示免疫功能低下者為CRKP的易感人群。英國(guó)曾經(jīng)發(fā)出警示，需洞察CRKP對(duì)碳青霉烯類抗生素耐藥性的“威脅”[29]。因此，面對(duì)KP對(duì)碳青霉烯類的耐藥率明顯上升趨勢(shì)，需引起臨床的高度重視，加強(qiáng)CRKP的耐藥性監(jiān)測(cè)，獲得常見(jiàn)臨床分離菌對(duì)碳青霉烯類抗生素的耐藥率，采取積極有效措施，控制耐藥細(xì)菌在全國(guó)范圍內(nèi)的傳播。

2 分子基因耐藥機(jī)制

在細(xì)菌耐藥性監(jiān)測(cè)的基礎(chǔ)上，開展適當(dāng)?shù)哪退幓驒z測(cè)和分子分型，可揭示耐藥菌的耐藥機(jī)制和傳播規(guī)律，為防治和控制耐藥菌傳播提供臨床依據(jù)。CRKP耐藥性與其產(chǎn)生及攜帶不同的耐藥基因密切相關(guān)。主要包括：①產(chǎn)碳青霉烯酶；②高產(chǎn)AmPC酶或超廣譜β內(nèi)酰胺酶（ESBLS）合并外膜的丟失；③膜孔蛋白基因缺失或表達(dá)下調(diào)；④外排泵基因高表達(dá)；⑤PBPS蛋白缺失或親和力下降等。上述耐藥基因可單獨(dú)或共同作用，從而降低碳青霉烯類抗生素耐藥或敏感性。

2.1 碳青霉烯酶 碳青霉烯酶是一類β-內(nèi)酰胺酶，能水解包括碳青霉烯類藥物在內(nèi)的幾乎所有β-內(nèi)酰胺類抗生素。按照Ambler分子分類，可進(jìn)一步分別為A，B，D 3類。

2.1.1 A類酶 A類酶包括GES、KPC、SME、SHV-38、SCF-1等，其中產(chǎn)肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶（Klebsiella pneumoniae carbapenemase，KPC）型最常見(jiàn)。KPC由質(zhì)粒介導(dǎo)，憑借可移動(dòng)元件，向不同菌株、菌種間迅速擴(kuò)散，造成院內(nèi)感染，并在不同地區(qū)間傳播、流行。目前發(fā)現(xiàn)KPC有19種基因型，其分布呈顯著地域特點(diǎn)。國(guó)外主要以KPC-3型為主，我國(guó)以KPC-2型多見(jiàn)。高倩倩[30]收集上海兩所教學(xué)醫(yī)院84株CRKP菌株分析常見(jiàn)耐藥基因，其中bla-KPC-2陽(yáng)性率為90.5%，克隆分型中ST-11型占71株（84.5%），提示CRKP耐藥主要與bla-KPC-2有關(guān)。ST-11為CRKP的主要克隆分型，呈克隆傳播趨勢(shì)。黃亞雨等[31]分析33株CRKP菌株，攜帶KPC基因32株，攜帶SHV基因30株，攜帶NDM-1基因1株；同源性分析顯示，ST-11/A型29株，ST-15/B型2株，提示CRKP耐藥與攜帶KPC耐藥基因有關(guān)，與SHV共同作用并致耐藥。大部分CRKP為ST-11型，同源性程度高，易在醫(yī)院內(nèi)克隆性傳播。

2.1.2 B類酶 B類酶為金屬β-內(nèi)酰胺酶，包括IMP，VIM，GIM，SIM，NDM（新德里金屬酶）等。其中最主要的為NDM，2008年首先在一位印度裔尿路感染患者中分離出并命名為NDM-1[32]，至今已發(fā)現(xiàn)NDM-1的15種蛋白位點(diǎn)突變體。在我國(guó)NDM-1不斷有報(bào)道并呈上升趨勢(shì)[33-35]，近年來(lái)在國(guó)內(nèi)外逐漸有產(chǎn)NDM-5腸桿菌科細(xì)菌的報(bào)道[36-38]。該類型NDM基因有共同的特點(diǎn)，即有獨(dú)特的基因序列，其基因元件位于質(zhì)粒上，易在不同菌株間轉(zhuǎn)移、傳播，引起廣泛耐藥，產(chǎn)生廣泛耐藥與質(zhì)粒水平傳播密切相關(guān)。攜帶NDM基因的KP除黏霉素外，對(duì)所有抗生素耐藥，被冠以“超級(jí)細(xì)菌”，大大增加CRKP感染的治療難度，已成為人類公共健康的主要威脅，成為臨床抗感染治療的主要挑戰(zhàn)。

2.1.3 D類酶 D類酶又稱苯唑西林酶（OXA酶）。在肺炎克雷伯菌中檢出最多的是OXA-48，有11種OXA-48型碳青霉烯酶的變體。Poirel等[39]最早在一個(gè)土耳其患者中發(fā)現(xiàn)，后迅速在美國(guó)、印度、中國(guó)等國(guó)家流行[40]。OXA-48型主要由質(zhì)粒編碼，可在不同菌屬的腸桿菌科細(xì)菌中傳播；攜帶該基因的肺炎克雷伯菌，可同時(shí)產(chǎn)生KPC，ESBLS酶等，表現(xiàn)出對(duì)碳青霉烯類的強(qiáng)水解活性；當(dāng)合并膜孔蛋白缺失或OmpK35和Omp K36的變異時(shí)，導(dǎo)致對(duì)碳青霉烯類抗生素高水平耐藥[41]。其他類型OXA酶也與CRKP耐藥有關(guān)。

2.2 AmpC酶 AmpC酶又稱頭孢菌素酶，有40多種基因型，國(guó)外以CMY-2型多見(jiàn)，我國(guó)多見(jiàn)類型為DHA-1型和ACT-1型[42]。Shi等[43]發(fā)現(xiàn)，DHA-1型伴隨膜孔蛋白（Ompk36）變異，可導(dǎo)致肺炎克雷伯菌對(duì)碳青霉烯類耐藥。AmpC酶以質(zhì)粒作為載體，通過(guò)接合，轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)導(dǎo)等方式，導(dǎo)入肺炎克雷伯菌體內(nèi)缺乏的AmpC基因，促使該菌產(chǎn)生AmpC酶，并使耐藥基因在不同菌株間轉(zhuǎn)移。質(zhì)粒介導(dǎo)的AmpC酶是肺炎克雷伯菌對(duì)碳青霉烯類抗生素產(chǎn)生耐藥性的主要原因。

2.3 膜孔蛋白基因缺失或表達(dá)下調(diào) 膜孔蛋白是肺炎克雷伯菌細(xì)胞外膜上一種特殊的水溶性通道蛋白，由OmpK35、OmpK36、OmpK37基因編碼，其中起關(guān)鍵作用的是OmpK35、OmpK36。膜孔蛋白是物質(zhì)交換的通道，碳青霉烯類抗生素通過(guò)膜孔蛋白進(jìn)入菌體內(nèi)，殺滅細(xì)菌，從而發(fā)揮抗菌作用[44]。當(dāng)膜孔蛋白缺失或表達(dá)下調(diào)時(shí)，抗菌藥物無(wú)法進(jìn)入菌體內(nèi)，從而產(chǎn)生耐藥。以往研究[45]發(fā)現(xiàn)，當(dāng)膜孔蛋白缺失同時(shí)合并產(chǎn)ESBls或AmpC酶時(shí)，才表達(dá)對(duì)碳烯類抗生素高水平耐藥。而羅洪英等[46]在分析70株CRKP菌株中發(fā)現(xiàn)：產(chǎn)KPC酶同時(shí)Ompk35表達(dá)下調(diào)占50.77%，缺失占9.23%；OmpK36表達(dá)下調(diào)占3.08%，缺失占55.3%；說(shuō)明產(chǎn)KPC酶同時(shí)合并膜孔蛋白的表達(dá)降低或缺失，與細(xì)菌耐藥性密切相關(guān)。而最新的研究[47]發(fā)現(xiàn)：質(zhì)粒介導(dǎo)的NDM-1酶合并OmpK36表達(dá)降低或缺失，是導(dǎo)致肺炎克雷伯菌對(duì)碳青霉烯類抗生素高水平耐藥的主要原因。

2.4 外排泵基因高表達(dá) 外排泵在肺炎克雷伯菌中廣泛分布，普遍存在。AcrAB-TolC外排系統(tǒng)是肺炎克雷伯菌最主要的外排泵，存在于細(xì)菌內(nèi)膜。研究[48]發(fā)現(xiàn)，外排泵基因被底物誘導(dǎo)激活后，呈高表達(dá)狀態(tài)，將進(jìn)入細(xì)菌中的抗菌藥物主動(dòng)排出體外，導(dǎo)致肺炎克雷伯菌產(chǎn)生耐藥性，甚至多重耐藥性。國(guó)內(nèi)zhuo等[49]首次從多重耐藥肺炎克雷伯菌中檢出mdf-A，Smr，tehA等外排泵結(jié)構(gòu)基因，證實(shí)AcrAB-TolC外排系統(tǒng)高表達(dá)會(huì)導(dǎo)致KP的多重耐藥。OqxAB外排泵系統(tǒng)是近年來(lái)在KP中發(fā)現(xiàn)的一種較新的外排泵，由OqxA和OqxB共同編碼，共同存在，其中OqxB起主要作用[50]，其主要通過(guò)促進(jìn)細(xì)菌生物膜形成，介導(dǎo)肺炎克雷伯菌產(chǎn)生耐藥。Filgona等研究[51]發(fā)現(xiàn)：應(yīng)用外排泵抑制劑后，CRKP對(duì)厄他培南、多尼培南的MIC值明顯降低，表明外排泵基因和其他耐藥機(jī)制共同存在，參與耐藥。

2.5 PBPS蛋白缺失或親和力下降 PBPS即青霉素結(jié)合蛋白，其位于細(xì)菌內(nèi)膜，是能與β-內(nèi)酰胺類抗生素共價(jià)結(jié)合的一類酶。β-內(nèi)酰胺類抗生素與PBPS結(jié)合后，干擾酶的正常功能，引起細(xì)菌自溶或形成球狀體、絲狀體，最終細(xì)菌分裂而發(fā)揮殺菌作用[52]。不同種類細(xì)菌所含PBPS不盡相同，但結(jié)構(gòu)和功能卻很相似。研究[53]證實(shí)，PBPS的結(jié)構(gòu)變異，數(shù)量改變或與抗生素親和力下降，是導(dǎo)致KP對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥的主要原因。還有研究[54]表明，PBPS通過(guò)靶位點(diǎn)改變，使進(jìn)入菌體內(nèi)抗生素不能與PBPS位點(diǎn)結(jié)合，因而不能發(fā)揮殺菌作用而耐藥。而最新的研究[55]顯示，多個(gè)PBPS聯(lián)合變異，可導(dǎo)致KP高水平耐藥。因此，PBPS蛋白缺失或親和力下降，對(duì)細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生起至關(guān)重要的作用。

3 小結(jié)與展望

肺炎克雷伯菌作為一種條件致病菌，是導(dǎo)致院內(nèi)感染和社區(qū)獲得性感染的主要細(xì)菌。碳青霉烯類抗生素是治療肺炎克雷伯菌感染的“中流砥柱”。但在強(qiáng)大的抗生素應(yīng)用壓力下，隨著臨床應(yīng)用不斷增加和濫用，CRKP檢出率不斷增加，CRKP感染逐年攀升，多重耐藥日益嚴(yán)重。CRKP耐藥性與其產(chǎn)生不同的耐藥基因，并通過(guò)質(zhì)粒傳導(dǎo)密切相關(guān)，遏制CRKP的進(jìn)一步流行傳播迫在眉睫。展望未來(lái)，積極開展CRKP菌株的主動(dòng)監(jiān)測(cè)，及時(shí)獲得分離菌對(duì)各種抗生素的耐藥率，指導(dǎo)臨床合理治療。在此基礎(chǔ)上，開展分子水平的耐藥基因檢測(cè)，揭示CRKP的分子耐藥機(jī)制和傳播規(guī)律，掌握本地菌株的流行趨勢(shì)和耐藥特點(diǎn)，有針對(duì)性的制定合理有效的預(yù)防控制措施，將有助于有效防止肺炎克雷伯菌多重耐藥的產(chǎn)生和蔓延。