人類輔助生殖培養液的質量控制和安全性評價

【作 者】趙丹妹，黃元禮，王春仁，柯林楠，韓倩倩

中國食品藥品檢定研究院，北京市，102629

0 引言

人類輔助生殖技術（human assisted reproductive technology，ART）主要是通過人工方式將配子（卵子和精子）在體外結合，形成受精卵后將其移植回母親子宮。是繼藥物、手術解決不孕不育問題后又一有效手段。人類輔助生殖技術主要包括體外受精、胚胎培養、胚胎移植三個過程。在此過程中尤其在實驗室中，會涉及大量的人類輔助生殖培養液[1]，比如在體外受精階段有精子顯微操作液、取卵-胚胎處理液、配子處理液、卵裂胚培養液、精子制動液；在胚胎培養階段有生長液、卵裂胚培養液、受精培養液、培養用油；在胚胎移植階段有胚胎膠、胚胎移植液等；在胚胎冷凍保存階段有卵裂胚冷凍液、卵裂胚復蘇液、囊胚玻璃化冷凍液、囊胚玻璃化復蘇液等。這一系列的培養液主要為配子和受精卵提供生存與發育的能量組分。而配子、合子及不同細胞階段的胚胎，對于微環境的變化十分敏感，不同階段使用的培養液的質量將直接影響著胚胎及后代的健康，所以，對于輔助生殖培養液的質量和風險控制尤為重要。

胚胎對于能量的利用有著不同發育階段的特異性。市場上有多種不同配方的培養基可供選擇，從簡單的鹽溶液到含有合成氨基酸和生長因子的復雜組織培養基。一般輔助生殖培養液的組成成分有鹽類、碳水化合物、維生素類、重組胰島素、乙二胺四乙酸（EDTA）、人血清白蛋白、抗生素、醇類、氨基酸類、石蠟油等[2]。而在這些產品中，每種組分的作用與其風險都應予以考慮，因為這些都關系著體外輔助生殖治療的安全性與有效性。輔助生殖培養液之間的差異能夠影響到胚胎的產前及產后發展、囊胚形成率、胚胎著床率、活產率、胎兒出生體重等重要環節[3-4]，需要嚴格對其進行質量控制。

目前，人類輔助生殖培養液在我國被作為第三類醫療器械進行管理，均需對其中的組分穩定性、降解產物與雜質的風險、添加藥物的質量進行控制。

1 人類輔助生殖培養液的成分穩定性控制

人類輔助生殖培養液在正常使用過程中，應確保不會對于配子、胚胎或者準媽媽的安全性產生不利影響。這就需要對于培養液中組分的穩定性進行控制。需要監測其中的關鍵組分，在產品的有效期內適當的儲存條件下，確保其含量在維持產品功能性的要求范圍內，且不產生不利影響。對于輔助生殖培養液類產品，在上市前的注冊檢驗過程中，應采用相應的檢測手段對于培養液中添加的主要成分如各種維生素、丙酮酸、葡萄糖、EDTA、氨基酸、人血清白蛋白、抗生素等的含量進行確定，確保其成分含量的有效性，進而確保產品質量。

維生素作為維持細胞生長的活性物質，在細胞中大多形成酶的輔基或者輔酶，對于細胞代謝有重大影響。脂溶性維生素（A、D、E、K）常從血清中得到補充。而水溶性維生素包括維生素B類（生物素、葉酸、煙酰胺、泛酸、吡哆醇、核黃素、硫胺素和B12）和維生素C。維生素C是不可缺少的，對具有合成膠原能力的細胞更為重要。而引起維生素降解的主要因素包括：培養液pH、氧化、光照（紫外）、加熱以及存在有能引起其它化學反應的活性物質。保證各種所需維生素含量的穩定性是維系合子、受精卵、胚胎發育正常的首要條件。如維甲酸（RA）被證明是細胞發育和分化、胚胎生長和生殖功能的重要調節器。RA也可以嚴格控制許多生殖事件，如卵母細胞發育、卵泡生長和胚胎早期生長。此外，RA還管理細胞的凋亡信號和氧化損傷[5]。再如硫辛酸屬于B族維生素中的一類化合物，是細胞利用糖類等能源物質產生能量所需的一種限制性必需營養物質，它還是一種有效的抗氧化劑和重金屬螯合劑。硫辛酸在多酶系統中起輔酶作用，可以催化丙酮酸氧化脫羧成乙酸及α-酮戊二酸氧化脫羧成琥珀酸反應中的轉酰基作用。有研究結果表明[6]，無論在培養期間施加的氧氣濃度如何，添加較高濃度的硫辛酸都會導致胚胎發育受損，而相對較低濃度的硫辛酸則會改善胚胎質量。那么就需要嚴格控制其含量的穩定性。需要持續研究維生素的不穩定性和反應特性，提高培養液的均一性，進而提高其成分的穩定性。

葡萄糖、丙酮酸、乳酸等成分在輔助生殖培養液中起著重要的作用。體外培養液中葡萄糖或丙酮酸鈉的含量過高時，會對卵母細胞的成熟產生抑制作用；而含量過低時，會導致胞質和胞核不同步成熟發育；同時，葡萄糖的濃度會直接影響到所述體外培養液的滲透壓[7]。現在普遍認為丙酮酸是胚胎植入前發育的所有培養基中的重要成分[8]。丙酮酸、乳酸等[9]三羧酸主要為受精卵的發育提供能量。體外培養發育到卵裂階段時，主要由丙酮酸和乳酸為胚胎供能，而后發育到致密化期及以后，主要依賴葡萄糖供給能量，并且葡萄糖可以抑制卵裂階段胚胎的發育，但對綿羊、豬植入前胚胎研究表明葡萄糖對其體外發育無抑制作用。丙酮酸是哺乳動物胚胎生長發育所必需的物質，葡萄糖可以為胚胎提供能量并以關鍵底物形式調控生物合成通路。葡萄糖[10]作為幾乎所有培養液必含的能源物質，是合成某些氨基酸、脂肪、核酸的原料，起著重要的作用。而在體外培養條件下，葡萄糖主要經糖酵解降解，產生乳酸。而過量的乳酸對體外培養不利，需要限制培養液中葡萄糖的含量，但葡萄糖含量過低可造成細胞營養供應不足，細胞生長抑制。此時則需要對葡萄糖的消耗與需求、乳酸的生產速率以及目的蛋白的表達量等參數進行綜合考慮。限定培養液中葡萄糖、乳酸、丙酮酸等成分的含量，降低或消除不利因素，維持其正常效用來確保培養液的安全性與有效性極為重要。

氨基酸[11]是合成蛋白質的必需原料，也是細胞代謝的關鍵產物。許多研究表明[12]，單個或多個氨基酸的限制會導致mRNA加工和細胞生長受阻，以及產物的氨基酸序列的改變。谷氨酰胺也是輔助生殖培養液中重要的組成成分。細胞需要谷氨酰胺合成核酸和蛋白質，谷氨酰胺缺乏可導致細胞生長不良甚至死亡。谷氨酰胺對細胞的培養特別重要，能促進各種氨基酸進入細胞膜；它所含的氮是核酸中嘌呤和嘧啶的來源，還是合成—磷酸腺苷、二磷酸腺苷和三磷酸腺苷的原料。在配制各種培養液中都應補加一定量的谷氨酰胺。值得注意的是：谷氨酰胺在溶液中很不穩定，可以降解生成不利于人體的氨。另外，天冬酰胺的存在也會降解產生氨。此時，更需控制這些成分的含量。目前，大多采用比其更穩定的丙氨酰谷氨酰胺作為谷氨酰胺的替代成分。

2 人類輔助生殖培養液組分的降解產物與雜質的風險控制

對于某些不穩定但關鍵的組分需要追蹤其降解規律與趨勢，考慮這些成分產生的降解產物對于最終的人類輔助生殖培養液的毒性和性能所產生的影響。培養液引入任何一個新的組分，都會有可能增加培養液產生副反應的可能性，從而增加培養液穩定性風險，因此需要結合每個反應特性來決定是否添加某種新的成分，如絡合劑/螯合劑通常會降低培養基組分的生物活性。結構類似物的選擇需要考慮轉運至胞內后，是否可以恢復其生理活性形式。

氨基酸在溶液中會自發地脫氨[13]，且已經證實培養液只需要培養一段時間就會釋放出大量甚至達到有毒性水平的氨。體外培養條件下，葡萄糖主要經糖酵解降解，產生過量的乳酸。乳酸和氨這兩種主要代謝廢物的積累都可以影響細胞生長以及培養液質量。所以它們作為代謝產物又需要嚴密追蹤其濃度變化，保證其濃度不會對培養液質量產生影響。

培養液中還常加入一些動物源性物質，如在“合成”透明質酸的生產過程中所用的血清白蛋白、從雞冠中提取的透明質酸等。為了盡量消除或減少從動物組織中帶來的風險的傳播，也要對這些組分進行相應的質量控制。

血清白蛋白作為蛋白質的主要來源，支持著胚胎的發育能力。血清白蛋白會帶來血液制品相關的某些疾病傳播的風險。血清白蛋白也給培養液帶來了結合脂肪酸和其他代謝產物，如檸檬酸鹽和類固醇[14]。有研究已經證明商用的用于人類輔助生殖技術的培養液的血清白蛋白制劑中含有大量未知蛋白質和過渡金屬[15-16]。此外，白蛋白的加工可能導致引入已知的化學物質，如用于穩定白蛋白卻已被證明對胚胎發育有害的辛酸[17]。在人類胚胎培養液中，還有研究人員提出作為蛋白質補充物的血清白蛋白可能是可檢測到的二（2-乙基己基）鄰苯二甲酸鹽和單（2-乙基己基）鄰苯二甲酸鹽以及多溴二苯醚的來源[18-19]。為了控制血清白蛋白所帶來的代謝廢物及其他未知有害物質，既要控制其含量確保有效性，又要跟蹤其有害降解產物的變化來保證安全性。為了降低由此所帶來的風險，重組人白蛋白被用作有效替代品，其臨床有效性也得以證實[20]。

為了評估輔助生殖培養液的總體風險，還有必要對產品進行臨床前測試。除了需要對于這些特殊組分及其降解產物的含量變化趨勢進行測試外，還應對其生物相容性進行評估，來確保產品的安全性。

3 人類輔助生殖培養液中添加藥物的質量控制

人類輔助生殖培養液中需要根據其功能性加入一些輔助藥物，如抗生素等，這些藥物的存在也會存在相應的風險。需要對這些成分的質量、安全性和有效性進行驗證。

細菌污染可以對胚胎的生長發育造成嚴重影響。細菌快速生長繁殖，既消耗了培養液中的營養成分，又釋放大量對胚胎有毒性的代謝物。大腸桿菌等革蘭氏陰性桿菌在繁殖或死亡時還釋放內毒素，對胚胎具有細胞毒性作用。而在培養基中加入適當的抗生素如慶大霉素可以有效地抑制細菌生長，保證胚胎正常發育[21]。但抗生素的引入，也可能會存在一定的副作用。氨基糖苷類抗生素在醫用領域有著不可替代的作用，但其使用上因毒性和耐藥性也受到一定限制。在臨床上氨基糖苷類抗生素是濃度依賴型抗菌藥物，嚴格控制其劑量非常重要[22]。而對于輔助生殖培養液更應重視，因為抗生素的存在可能會對胎兒產生風險。需要對培養液中的抗生素進行質量控制，降低其產生的風險。

在培養液中也會根據其用途加入相應的激素和生長因子，這對于維持培養液的功能，保證細胞的生長狀態等具有重要的作用。有些激素對某一類細胞有明顯促進作用，如適宜的胰島素含量可以促進細胞利用葡萄糖和氨基酸。

雌二醇（E2）作為一種類固醇激素，能夠促進卵泡等雌性生殖器官發育。促黃體生成素（luteinizing hormone,LH）是一種糖蛋白類促性腺激素，對卵子最后的成熟是必須的。成熟卵子的排出與LH峰的出現相關，培養液中LH的存在加速卵母細胞的成熟，隨著LH濃度的增高，這種作用越大，同時卵子老化的速度也越快。因此，高LH濃度組中培養48 h的成熟卵子，其受精能力極顯著地低于其他組，也極顯著地低于相同培養條件下24 h組，培養液中LH含量對培養較長時間的成熟裸卵的體外受精率有極顯著的不利影響[23]，故需嚴格控制其含量。

胰島素生長因子[24]（insulin like growth factor，IGF）通過與特異性的靶細胞表面受體IGF-IR結合，能夠促進顆粒細胞增殖并維持芳香化酶的功能，從而提高了雌激素的合成，并且促進了卵泡進一步發育；而隨著雌激素的增多，卵泡對激素的敏感性增強，最終達到了促使卵泡迅速生長的效果[5]。表皮生長因子（epidermal growth factor,EGF）通過自分泌和旁分泌的形式調節早期胚胎的發育。在胚胎培養液中加入適當濃度的EGF改善體外受精-胚胎移植的培養環境，將胚胎培養到更合適的階段再移入子宮，就可能提高其成功率[25]。

現在國內已經有一系列的人類輔助生殖技術產品的相關標準發布。很多國家監管部門也出臺了相關的文件，如中國國家藥品監督管理局醫療器械審評中心發布了《人類體外輔助生殖技術用液注冊技術審查指導原則》[26]，歐盟發布了《Guidelines for Conformity Assessment ofin VitroFertilisation (IVF) and Assisted Reproduction Technologies (ART) Products》[27]。但目前尚未有質量技術標準對成分含量的指標進行明確要求。對于輔助生殖培養液中其他有效成分以及有害降解產物、有關藥物等成分含量檢驗方法的建立，并建立相關的質量標準迫在眉睫。確保在產品貨架期內的安全性和有效性，對輔助生殖培養液進行有效的質量控制，才能進而提高輔助生殖技術的安全性和成功率。