人類輔助生殖技術用醫療器械精子毒性檢驗

【作 者】連環，陳虹，韓倩倩

中國食品藥品檢定研究院，北京市，102629

0 引言

為配合人類輔助生殖技術的發展，人類輔助生殖用醫療器械的開發層出不窮，其涵蓋了所有與精子、卵母細胞或胚胎直接或間接接觸的培養基類及器具/耗材類產品，而精子毒性檢測是此類產品安全有效性評價中不可或缺的一環?，F有的YY/T 1535規定了人精子存活試驗的相關細節[1]，但對于其不適用的精子優選類和精子制動類產品還需進一步探索各自特定的性能指標及檢測方法。同時為了加快產品檢驗流程，避免對人精子資源的浪費和倫理審查之類的煩瑣流程，人精子替代試驗也是值得關注的方向。

1 人類輔助生殖技術及相關醫療器械的種類、風險與監管

人類輔助生殖技術（human assisted reproductive technology，ART）是20世紀70年代興起的，通過運用醫學技術和方法對配子、合子、胚胎進行人工操作，從而使不育夫婦妊娠的技術，涵蓋了人工授精（artificial insemination,AI）和體外受精-胚胎移植（in vitrofertilization and embryo transfer,IVF-ET）技術及其各種衍生技術[2-4]。ART相關醫療器械類產品主要有各種培養液、沖洗液、緩沖液、冷凍液等培養基類產品；還有各種培養皿、取卵針、顯微注射針以及其胚胎移植導管等耗材器具類產品。這些產品在ART操作過程中均與人類配子和/或胚胎發生直接或間接接觸，因此不孕不育患者在使用它們的同時也面臨著巨大的風險，因為其安全性不僅影響著患者，還有可能影響患者后代的健康和發育安全[5-6]。綜上所述，亟須對此類產品加大監管力度，以保障廣大民眾的用械健康，而我國也對ART相關醫療器械給予了高度的重視，并建立了特殊的監管體制[7-9]。由于目前在我國市場上使用的各類產品中培養液及保存液類產品主要為進口產品，國內大多數生產企業還處于起步階段但發展迅速，多數產品現處于申請注冊前檢驗或申請注冊階段，所以我國也正在積極推進人類輔助生殖技術用醫療器械的標準化工作，以期為相關產品的順利注冊以及行業的健康發展保駕護航[10-12]。

2 相關器械針對人精子的安全性檢測以及功能性檢測

2.1 人精子存活試驗是可用于大多數產品安全性的檢測試驗

ART類醫療器械的安全性評價因為其臨床用途的特殊性，往往需要增加其對人類配子（如精子）的影響。2017年國家食品藥品監督管理局就發布了《人類體外輔助生殖用醫療器械 生物學評價 人精子存活試驗》（YY/T 1535-2017），用于評價ART器械中與精子、卵母細胞或胚胎直接接觸的培養基類及器具/耗材類產品可能產生的毒性風險[1]。人精子存活試驗就是利用人類精子與供試品或其浸提液共孵育后人精子活力的變化來間接判斷受試物對精子、卵子或胚胎的潛在毒性，其中對于人精子的活力用試驗中前向運動精子（progressive motility，PR）占全部精子（前向運動，不活動和非前向運動精子的總和）數量的百分比來表征，也即：精子活力=（前向運動精子/精子總數）×100%。

但值得注意的是，此試驗并不適用于精子制動液（因為其造成精子運動能力的明顯下降）、透明質酸酶（影響精子膜進而影響精子運動）及配子/胚胎冷凍復蘇液（明顯不利于精子運動）等產品的檢測。

2.2 對于人精子存活試驗不適用的產品可根據其產品特性制定其功能性試驗

對于以上這些ART產品，可采用鼠胚試驗替代人精子存活試驗[13]，且應當根據其各自特殊的功能，研究增加其特定的性能指標，制定相關功能性檢測試驗及相關標準。比如說在《人類體外輔助生殖技術用液注冊技術審查指導原則》中就規定了，對于精子密度梯度分離液等密度梯度離心介質及組織培養油，還需制定其密度指標[14]；組織培養油和精子制動液等產品還需制定其黏度要求等理化指標。同時對于精子密度梯度分離液等精子優選產品應制定活動精子回收率、處理后精子活力提升率等指標，精子制動液也應制定精子制動性能等功能性指標[15-16]。

精子活力提升試驗是基于存活試驗的拓展，通過模擬精子優選類產品的臨床使用過程，來研究經過產品處理后及處理前的精子活力的差異——精子活力提升率，也即：精子活力提升率=處理后精子活力-處理前精子活力。

并根據活力提升率的大小來說明相關產品是否能實現其描述的功能[17-18]。當然對于此類產品，僅僅是精子活力提升率一個指標還不足夠，因為如果其使得精子數目劇烈下降而不足以滿足臨床使用要求時，該產品的有效性也是值得商榷的[19-20]。因此我們添加了另一個指標——活動精子回收率，也即：活動精子回收率=（處理后活動精子總數/處理前活動精子總數）×100%。

通過這兩個指標，就可以比較完整地描述精子優選類產品的有效性。

而精子制動類產品的主要功能是在對精子進行顯微操作時人為降低精子活動力從而達到便于操作的目的，因此評價方法與指標也要做出相應調整[21]。需要注意的是，此時我們選擇的表征量是精子活動力而不是精子活力，因為精子活力的定義僅僅是試驗中前向運動精子占全部精子數量的百分比，不足以細節化描述精子運動情況[22-23]。精子活動力一般用精子的直線運動速率表示，可通過顯微鏡同計數板配合進行目視測量，也可使用計算機輔助分析系統（computer-aided sperm analysis,CASA）對其進行更快捷、客觀計量[24-26]。類似于精子優選類產品，精子制動類產品的制動性能可通過經產品處理后的精子活動力或者精子制動率來表示，也即：精子制動率=（處理后精子活動力/處理前活動活動力）×100%。

這些功能性試驗不僅僅可以驗證相應產品的安全性，還可以間接反映其有效性，因此也是未來試驗開發重點研究方向。

3 關于人精子試驗替代方法的探索

ART的出現改變了人類傳統生育方式，在造福人類的同時也帶來了諸多倫理道德和社會法律問題，精子攜帶著人體一半的核酸信息，具有同卵子結合后發育成完整個體的潛能，因此涉及精子的使用往往需要通過多道倫理審查程序[7-9]。而且國內精源短缺的現象十分普遍，在捐獻精子人數有限的情況下，使得眾多不孕不育家庭順利得到解決仍是個嚴峻的問題，因此業內也有人表示采用人精子進行相關試驗是一種對資源的浪費[27-29]。此時，尋找一個可替代的動物精子模型也成了新的發展趨勢。作為常見的家畜，豬牛兔的精子來源比較可靠，且其外部形態與人精子無明顯差異，均具有頭、頸、尾三個部分[30-31]。根據現有數據可知，豬、牛精子的頭頸長度比率與人精子類似，但尾部差異相對較大。特別是豬精子曾在多篇關于精子優化方法和精子速率檢測的研究文章中被使用，其操作過程基本與人ART技術的一致，且試驗結論也具有一定的可推廣性[32-34]，因此可作為人精子的替代生物材料進行試驗。但是因為是動物來源材料，仍需要對其病原體去除以及對精子獲能動力等過程進行驗證并與人精子比較，以確認其適用性[35-36]。

除了使用動物精子模型替代人精子這個思路外，進行其他替代試驗也是另一個探索方向，比如上文提到的，制動液類產品不適用于精子存活試驗時可用鼠胚試驗代替[13]。因為精子存活試驗和鼠胚試驗都能達到驗證環境或材料對配子細胞或胚胎是否具有毒性的目的，因此二者被廣泛應用于評估IVF-ET實驗室及其配套儀器耗材質量，比如說新安裝的培養箱就需要以已運行培養箱為對照進行精子存活或鼠胚試驗，檢驗合格后才可以啟用[37]。但相較于鼠胚試驗，因為精子存活試驗具有靈敏性高，操作簡便等優點，是IVFET實驗室應用最為廣泛的質控試驗。且鼠胚試驗雖進行結果的判定，但無論是采用顯微鏡同計數板配合進行目視測量還是計算機輔助分析系統（CASA）都只能在同一時間觀察單個焦平面上的精子狀況，因此對于其整體狀況的評估也需要進一步驗證的質量[38]。

4 思考與討論

隨著世界范圍內人類輔助生殖技術的發展，我國相關技術與標準化體系也有了長足的進步。但不得不承認的是相關標準制修訂工作仍存在著大片空白，比如說除人精子存活試驗外其他適用于人精子優選類產品或制動類產品的安全性及功能性試驗尚無統一標準。特別是此類試驗往往需要通過精子活力或精子活動力進行結果的判定，但無論是采用顯微鏡同計數板配合進行目視測量還是計算機輔助分析系統（CASA）都只能在同一時間觀察單個焦平面上的精子狀況，因此對于其整體狀況的評估也需要進一步驗證后進行約定。除此之外，談及人精子試驗就一定無法回避倫理問題，因此進一步探索人精子的替代試驗也會是未來人類輔助生殖技術用產品毒性評價的重要方向。