MicroRNA在肺癌順鉑耐藥機制的研究進展

白思特 韋忠恒

廣西壯族自治區百色市右江區右江民族醫學院附屬醫院,廣西 百色 530000

非蛋白質編碼微小RNA(microRNA,miRNA)是一類長度約20-25個堿基對構成的非編碼小分子單鏈RNA，它通過與靶mRNA 的3’UTR特異結合，引起mRNA降解或者翻譯抑制，調控基因表達[1]。到目前為止已經報道的人類miRNA的數量超過21,000,它調節超過60%的蛋白質編碼基因的表達。目前已確定 miRNA在調控免疫系統、細胞增殖和分化、生長發育、腫瘤和細胞周期中有著重要作用。miRNA同時與惡性腫瘤密切相關，可以促進或者抑制腫瘤發生[2]。第一個被發現的miRNA(lin-4)存在于秀麗隱桿線蟲中，它調控 lin-14基因的蛋白質表達[3];幾年之后在線蟲中發現第二個miRNA(let-7)[4]。這兩個miRNA的發現促進了成為生命科學和醫學研究的熱點之一，目前miRNA已經成為人們闡明一些重要疾病的發生機制和進行疾病診斷與治療的新切入點。

1 微小RNA在腫瘤中生物學功能

2002年Calin等[5]首次在慢性淋巴細胞白血病(CLL)中發現has-miR-15a和has-miR-16-1下降或缺失，特別是在試圖識別染色體13q14上的腫瘤抑制基因時，該基因在CLL中經常缺失。這個關鍵區域并不包含編碼腫瘤抑制基因的蛋白質，而是實際上包含了兩個在同一多順反子RNA中表達的miRNA基因：miR-15a、miR-16-1。這一結果首次證明了miRNA可能與人類癌癥的發病機制有關，由此確立了miRNA與腫瘤的相關性。先前研究發現miRNA的特異性表達與腫瘤的發生和發展有關，其中一些miRNA呈現出促癌或抑癌作用[6]。比如miR-135a 抑制劑對miR-135a的阻滯使 MES-SA和A549紫杉醇耐藥細胞系對紫杉醇誘導的細胞死亡敏感[7]。抑制miR-221或miR-222 表達使MDAMB-468細胞對他莫昔芬誘導的細胞生長停滯和凋亡敏感[8]。miR-451的過表達通過上調MDR1表達使乳腺癌細胞系MCF-7對阿霉素敏感[9]。miR-214的增加和let-7i的表達減少與卵巢癌細胞系中的順鉑耐藥性有關[10-11]。這些研究也進一步證實了miRNA的新的作用，即miRNA不僅參與細胞增殖、分化、凋亡、周期調控，而且對化療耐藥也產生重要影響。Cao等[12]研究順鉑耐藥的A549細胞的生存能力及miR-192-5P和Bcl-2的表達水平時發現，順鉑耐藥的A549細胞中miR-192-5P的表達水平明顯低于正常細胞，miR-192-5P主要作用于Bcl-2，進一步證實通過抑制miR-192-5P使Bcl-2蛋白表達量明顯增高，導致細胞凋亡受阻，從而產生耐藥性。秦學博等[13]PC9和PC9/AB11細胞株microRNA表達譜存在明顯差異，初步篩選到了13個與肺腺癌吉非替尼耐藥密切相關的miRNAs，為進一步深入研究miRNA在肺腺癌吉非替尼獲得性耐藥中的作用及其分子機制提供了實驗依據和理論基礎。并由以上的研究發現miRNA與腫瘤的具有一定的相關性。這些研究也從一方面證實miRNA不斷影響著我們目前治療的諸多方面，從而為我們治療腫瘤擴大了更廣闊的空間。

2 順鉑耐藥的機制研究 順鉑(Cisplatin)是最為常見第三代鉑類藥物

能與腫瘤細胞中的DNA發生交叉聯結，從而破壞DNA的功能[14]，從而激活腫瘤細胞的凋亡途徑，對多種腫瘤細胞均有很好的殺傷活性。先前成功的案例如在睪丸癌中，聯合博來霉素和依托泊苷使順鉑的治愈率高達95%[15]，除了在睪丸癌中突出成功以外，其他廣泛的多種實體腫瘤，如卵巢、肺、膀胱、頭頸、宮頸腫瘤也被證實對順鉑有高度的反應[16]。雖然順鉑是如此高效，但在治療周期中獲得的固有耐藥性和耐藥性是相對常見的，這些是目前順鉑抗癌治療中的主要挑戰。產生耐藥的原因有許多，比如DNA損傷的識別、HER-2/neu基因的過表達、PI3-K/Akt通路的激活、p53功能的缺失、抗凋亡基因bcl-2的高表達、細胞凋亡途徑caspase途徑干擾等。順鉑在低氯濃度條件下，通過水合過程變成高度活性的共價順鉑，與DNA堿基結合，形成DNA加合物。順鉑誘導的DNA加合物阻止轉錄和DNA合成，進而觸發復雜的細胞內信號轉導級聯，細胞有計劃地試圖消除病變。如細胞周期被阻止，為DNA修復機制移除損傷提供了足夠的時間。在修復受損或過度損傷的情況下，細胞會發生凋亡。一旦順鉑引起許多不同的DNA損傷，大多數主要的DNA修復系統都參與消除順鉑引起的DNA損傷。DNA損傷修復有多種方式，比如核苷酸切除修復(NER)、錯配修復(MMR)、同源重組(HR)和非同源末端連接(NHEJ)都一起參與了順鉑誘導的DNA損傷后的修復過程。此外順鉑引起的DNA損傷還可以通過一種稱為跨病變合成(TLS)的系統簡單地復制受損分子來耐受。其中順鉑產生的大量DNA加合物主要由核苷酸切除修復(NER)途徑修復。這種修復機制由兩條子路組成：全球基因組修復(GGR)，它識別和修復整個基因組的損傷；轉錄偶聯修復(TCR)，它處理主動轉錄基因的病變。這一系列復雜過程主要由內切酶XPF/ERCC1和XPG主要參與[17]。Ferry等[18]研究表明核酸苷切除修復NER的增強可導致細胞株的耐藥,進一步的研究也證實內切修復交叉補體1(ERCC1)的過表達也與順鉑耐藥有關。據報道，多個miRNAs通過靶向DNA修復基因參與DNA損傷修復。MiR-192通過抑制HepG2細胞中的ERCC3和ERCC4來抑制NER[19]。在順鉑作用下，過表達miR-33b-3p的A549細胞表現出較低的γH2A.X水平，這就表明miR-33b-3p促進了DNA損傷修復。此外，miR-33b-3p的異位表達增強了ERCC1在A549細胞中的表達，這在NER對順鉑-DNA加合物的修復中起著關鍵作用[20]。但是miR-33b-3p調控ERCC1表達的分子機制仍需進一步研究。雖然目前尚有機制暫未明確，但是這也無法忽略順鉑化療治療睪丸癌在臨床上取得的成功。睪丸癌細胞對順鉑的超敏反應反映了臨床反應，為了揭示可能解釋這種現象的分子機制，人們進行了大量的研究[21]。數據表明，睪丸細胞的DNA修復缺陷是該類型腫瘤對順鉑高度敏感的決定因素。事實上，睪丸細胞系修復鉑-DNA加合物的能力低于膀胱系細胞系，無論是在整個基因組中還是在活躍轉錄的基因中都觀察到了這一點。隨后，通過測定細胞提取物去除鉑-DNA加合物的能力，證實睪丸癌細胞株的DNA修復能力較低，在細胞提取物中加入XPA蛋白足以恢復體外DNA修復能力。有趣的是，在紫外線照射的細胞[22]中沒有發現XPA是NER的限速蛋白，后來在用順鉑處理的睪丸癌細胞系中也發現了這一點，這表明低水平的XPA蛋白并不是增加對順鉑敏感性的原因[23]。最近有研究顯示與膀胱癌細胞系相比，睪丸癌細胞系被證明具有正常的鏈內加合物和鉑-DNA加合物修復，但ICL修復水平降低。在這些研究中，睪丸細胞中低水平的ERCC1-XPF復合體與低ICL修復密切相關，這種蛋白復合體似乎是這些損傷修復和細胞順鉑耐藥的限制因素[24]。順鉑對其他腫瘤具有與一線治療相似的療效，這一事實有力地表明DNA修復機制在耐藥中起著重要作用，也為miRNA對腫瘤治療提供了新的研究方向。

3 MiRNA在腫瘤順鉑耐藥的作用

miRNA對順鉑轉運的調節關鍵在于細胞內順鉑的濃度。順鉑的耐藥性是由于進入細胞的藥物被更好地清除，以及細胞被損傷后DNA修復機制的高效率導致的。順鉑被細胞大量泵出，促使細胞內順鉑濃度降低，從而導致耐藥。但是由于順鉑轉運的方式多樣，我們不能簡單地通過增加劑量來克服細胞耐藥性，因為我們細胞還可以通過調節順鉑的轉運蛋白促使細胞耐藥。ABC轉運蛋白家族(ATP-binding cassette transports Family)是一組跨膜蛋白，具有ATP結合區域的單向底物轉運泵，它是以主動轉運的方式完成細胞對順鉑的跨膜轉運。銅轉運P型三磷酸腺苷ATP7A和ATP7B是目前研究發現促使鉑類藥物流出細胞的兩類轉運蛋白，這兩類轉運蛋白在順鉑耐藥的細胞中明顯高表達[25-26]促使順鉑轉運能力下降，進一步導致耐藥。Song等[27]研究發現，miR-495-3P可靶向下調ATP7A促使細胞對順鉑耐藥。在ATP7A的30個非編碼區中，miR-495有3個結合位點，miR-495的抑制對攜帶第一和第二miR-495結合區突變的載體中的GFP強度沒有影響，但阻斷miR-495會影響含有第三結合位點突變的突變載體中的EGFP強度。可以解釋的是，第三個結合位點在miR-495對ATP7A的調控中起著次要的作用。在70%的食管癌患者腫瘤細胞中存在金屬硫蛋白的過表達，它的過表達被發現與順鉑的耐藥性有關[28]。

miRNA對細胞周期的調節 細胞周期依賴性激酶(CDK)是一組絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，其主要作用是控制細胞周期轉換。這些酶包含兩個亞基，一個催化CDK亞基，一個激活CDK的調節周期蛋白亞基。兩類細胞周期蛋白-CDK調節細胞從靜止狀態進入S期：D型細胞周期蛋白激活CDK4/6，細胞周期蛋白E激活CDK2。細胞周期蛋白E2是細胞周期蛋白E家族的成員，其主要功能是通過CDK2的結合和Rb蛋白的磷酸化使細胞從G0/G1期過渡到S期[29-30]。miR-25在小細胞肺癌細胞和人小細胞肺癌腫瘤組織中均過表達，在H510A細胞中下調miR-25-3P的表達不僅可以降低腫瘤細胞對順鉑的耐藥性，而且同時可以降低其生長速度和侵襲能力。通過進一步研究發現下調miR-25-3P能導致下游因子CDK2和CyclinE的表達量降低，從而誘導細胞周期G1阻滯[31]。miR-545在肺癌組織中不如在鄰近的非癌性組織中豐富.這表明miR-545在肺腫瘤中表達不足，可能作為腫瘤抑制因子發揮作用。研究證實細胞周期蛋白D1和CDK4基因是miR-545的直接靶標,miR-545在G0/G1期誘導細胞周期停滯，因此也讓miR-545成為肺癌治療的潛在靶點[32]，進一步印證了miRNA對細胞周期影響順鉑耐藥。

miRNA對EMT的調節 EMT這一過程始于原發腫瘤，癌細胞失調細胞黏附，下調E-cadherin等蛋白質，上調Vimentin和N-cadherin等更具運動性、間充質樣表型的蛋白質。這一系列過程被稱為上皮向間充質轉化(EMT),EMT是上皮細胞來源的惡性腫瘤細胞獲得遷移和侵襲能力的重要生物學過程[33]。同時通過研究也發現EMT是NSCLC細胞對順鉑產生耐藥的重要原因之一[34]。Demin Jiao研究[35]通過PC-9細胞和HCC-827細胞的EMT標志物E-cadherin和Vimentin的免疫熒光染色證實，miR-1-3p和miR-206抑制了Akt和Erk途徑下游的c-Met，并阻斷了HGF誘導的上皮-間充質轉化(EMT)，這一證據提示miR-1-3p和miR-206逆轉HGF刺激的肺癌細胞EMT可能是克服吉非替尼耐藥的另一個重要機制。順鉑耐藥的肺腺癌細胞表現出EMT特征并增強多藥耐藥1(multiple drug resistant，MDR1)基因MDR1的表達，以往的研究表明化療藥物可以誘導EMT，增強侵襲能力，導致耐藥[36-37]。Snail和ZEB1是兩個重要的EMT誘導劑[38]。多藥耐藥基因1(MDR1，ABCB1)編碼P-糖蛋白(P-gp)，通過降低藥物有效細胞內濃度，成為耐藥的藥物載體之一促進耐藥[39]。Qing等[40]發現miR-206在人肺腺癌順鉑耐藥細胞中的過度表達通過靶向MET并抑制其下游PI3K/AKT/mTOR信號通路來抑制EMT和順鉑耐藥。通過檢測PI3K選擇性抑制劑LY294002或mTOR抑制劑雷帕霉素處理A549/DDP細胞后發現miR-206的低表達和高水平的MET與肺腺癌患者順鉑敏感性差密切相關，Snail和ZEB1等EMT相關轉錄因子的表達減少是miR-206水平下調到EMT的分子機制之一。miR-206的激活或其靶基因途徑的失活可能是逆轉人肺腺癌順鉑耐藥細胞順鉑耐藥性的潛在策略。此外miRNA也能通過諸如細胞凋亡途徑、細胞自噬等多種方式影響細胞耐藥，以上多種形式和通路的出現也為miRNA的影響順鉑耐藥提供了新的研究思路，為我們解決耐藥提供了更加廣闊的前景。

4 肺癌中MiRNA的研究進展

肺癌是我國發病率和死亡率最高的惡性腫瘤，2015年我國新發肺癌病例約為73萬，因肺癌死亡病例約為61萬人，嚴重威脅人類健康。目前盡管肺癌的多種治療模式，諸如手術、化療、分子靶向治療、放射治療、免疫治療等越來越趨于規范，同時以基因測序等更加精準的檢測手段的出現，肺癌診斷和治療取得了長足的進步，但是由于肺癌患者早期癥狀不明顯，很大一部分患者在確診肺癌時達到Ⅲ期，其中超過50%僅接受手術治療的肺癌患者會在5年內出現腫瘤復發或遠處轉移，進而導致治療的失敗。盡管目前治療手段如此繁多，但是肺癌的治療仍舊很難取得進展，這也從另一方面激勵著miRNA的研究的不斷深入。

miRNA抑制肺癌轉移MiR-138-5p被認為是一種腫瘤抑制因子，它與癌旁組織相比，miR-138-5p在許多癌組織中的表達降低，并且miR-138-5p的表達降低與患者的臨床病理因素和生存不良密切相關。在非小細胞肺癌病例中，miR-138-5p參與GADD45A的升高并抑制細胞生長。miR-21的靶點已被證明是多個腫瘤抑制基因的mRNA，包括PTEN、PDCD(programmed cell death)、TPM1(tropomyosin 1)和SerpinB5(serpin peptidase inhibitor, cladeB member 5)基因，這些基因不僅對癌細胞惡性轉化起負調控作用，而且能夠抑制細胞運動和侵襲。

miRNA與肺癌放射治療 放射治療(RTH)的主要目的是通過電離輻射破壞腫瘤細胞，這可以導致患者康復(根治性放射治療)或者緩解與局部腫瘤發展或轉移相關的疾病癥狀(姑息性放射治療)。這兩種治療方案對診斷為非小細胞肺癌(Non-small cell lung cancer，NSCLC)的患者尤其重要。根治性放射治療常應用于NSCLC的Ⅲ期，以及早期(I-II期)的患者，除非腫瘤相關原因而喪失手術資格或因患者決定退出手術。然而，根治性放射治療的研究結果仍不令人滿意。只有大約20%的I、II期患者和高達10%的III期患者實現了5年生存率。在Wang等研究中發現miRNA-21與細胞對輻射反應的相關性。在6Gy劑量輻射后分別在0、2、4、6和8小時檢測A549細胞中miRNA-21的表達。輻射后miRNA-21表達增加。其水平在4小時后增加，這一現象可能與其調節細胞對RTH的反應有關。為了證實這些發現，進一步研究表明通過RNAi在A549細胞中敲除了miRNA-21，然后將細胞暴露在輻射中。結果表明，經miRNA-21基因敲除的A549細胞的存活率明顯低于對照細胞。此外，miRNA-21基因的下調抑制了A549細胞的生長和增殖。綜上所述，由于miRNA-21的低表達抑制了A549細胞的增殖，并使細胞對輻射敏感，因此miRNA-21被認為是一種可能的新的RTH應答標志物。此外他們還研究了miRNA-21的另一種作用機制。研究結果表明，miRNA-21的過表達增加了A549細胞的輻射抗性，上調了EGFR/HER2信號通路，這可能與上皮-間充質轉化(細胞侵襲、遷移和血管化)EMT有關。在小鼠模型中，與單獨治療相比，聯合應用抗miRNA-21和放射治療可逐漸降低腫瘤負擔。miRNA-21具有輻射抗性和不同的上皮-間充質轉化特征。MiRNA-21的下調可能是一種新的潛在策略，通過調節輻射反應和上皮-間充質轉化中涉及的促生存信號來提高RTH的效率。其他幾種miRNAs作為癌細胞對輻射反應的標志物也被研究過。在A549細胞系中，miRNA-451也可能參與其中。miRNA-451的過表達可增強輻射對A549細胞集落形成能力的抑制作用，也可通過激活PTEN的表達來增強輻射對A549細胞集落形成能力的抑制作用。這兩種機制都可能通過促進細胞凋亡而導致肺癌細胞的放射增敏。

5 miRNA的前景展望

順鉑在抗腫瘤藥中屬于研發較早、臨床應用較廣并且作用較為顯著的一種腫瘤治療藥物，但是耐藥性同時限制了順鉑的治療，這一限制同時也是化學治療上面臨的主要挑戰。miRNA在肺癌順鉑耐藥性中的研究尚處于初級階段，大量通路機制尚不明確，目前已經知道miRNA可調控約三分之一的蛋白編碼基因的表達，影響著一些信號傳導通路，我們通過在不同腫瘤組織中miRNA表達水平的研究和分析發現，miRNA通過調節腫瘤耐藥及影響肺癌細胞的惡性生物學行為如腫瘤的轉移與侵襲、肺癌細胞的增殖與凋亡、腫瘤血管新生，參與肺癌的發生與演進過程，為肺癌臨床治療提供了新思路。同時miRNA也是具有巨大潛力的分子標志物,以miRNA為靶點設計新的藥物將為阻斷腫瘤轉移、改善患者預后提供更加有效的治療途徑。隨著研究深入我相信有效的miRNA調節劑將會在不遠的未來出現，會為腫瘤治療開辟新的治療手段。