不同方式運動對生長期大鼠TGFβ/BMP信號通路及骨生長的影響

趙常紅，李世昌，孫 朋，劉 媛，胡曉磐，徐 帥

軟骨細胞是一種特異性骨骼細胞。生長板軟骨細胞的肥大是骨縱向生長的基礎(chǔ)，軟骨細胞合成和分泌細胞外基質(zhì)（extraceellular matrix，ECM）的基礎(chǔ)。生長板的軟骨細胞分為增殖層、肥大層，軟骨細胞基本成列整齊排列，有序地進行增殖肥大，負責長骨的縱向生長（Sun et al.，2014）。轉(zhuǎn)化生長因子 β（transforming growth factor β，TGFβ）作為調(diào)控軟骨細胞分化與成熟的重要途徑，在關(guān)節(jié)軟骨的形成、軟骨特性的維持和生長板軟骨內(nèi)成骨過程中發(fā)揮著重要作用，同時TGFβ是一種有效的體外誘導(dǎo)間充質(zhì)干細胞（mesenchyma stem cell，MSC）成軟骨細胞的分化劑（Wu et al.，2016），MSC聚集后，TGFβ信號進一步刺激軟骨細胞增殖，同時抑制軟骨細胞肥大和成熟（Song et al.，2007）。相反，BMP/Smad1、Smad5、Smad8通路的活化刺激肥大化標記Col10的表達，但隨之刺激MMP13（Hellingman et al.，2011）。TGFβ抑制軟骨細胞終末肥大分化，通過Smad2/3維持正常軟骨（Studer et al.，2012）。縱向骨生長只發(fā)生在軟骨，TGFβ1在人類已被證明可調(diào)控軟骨細胞肥大化（Narcisi et al.，2012），調(diào)節(jié)生長板軟骨內(nèi)骨化過程實現(xiàn)，特別是在軟骨內(nèi)成骨過程中有維持靜息層軟骨細胞特性的作用（Kronenberg，2003；Yeung et al.，2014）。通過不同方式的運動來調(diào)節(jié)TGFβ/BMP信號通路，從而調(diào)節(jié)生長板增殖肥大影響骨縱向生長的研究目前鮮見報道。本實驗采用不同方式的運動，如非負重運動（如游泳）、自負重運動（如跑步）和超自重運動（如跳躍練習(xí)）的方式，比較生長板軟骨細胞肥大產(chǎn)生的變化，從骨組織生長的表型、細胞和細胞因子3個層面進行求證闡述。兒童青春期是身高增加的關(guān)鍵時期，而且SD大鼠作為研究生長板的動物模型，4周的SD大鼠相當于人的兒童期，12周相當于人的青春期后期（Andreollo et al.，2012），所以本實驗以4周齡的SD大鼠3周適應(yīng)性訓(xùn)練開始，運動6周后處理、取材，相當于青春期快結(jié)束基本成年階段，身高基本定型。在這個年齡段研究不同的方式運動對生長板軟骨細胞及細胞因子的影響，探究不同方式的運動如何通過TGFβ/BMP信號通路調(diào)節(jié)兒童青少年生長板軟骨細胞，最終影響骨縱向生長的可能機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

本研究采用4周齡48只清潔級SD大鼠（雄性）作為實驗動物，全部購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司。隨機分成4組，每組12只，即對照組（control group）、游泳組（swimming group）、跑臺組（running group）和下跳組（down jump group），以下分別簡稱C組、S組、R組、D組。各組分籠飼養(yǎng)，每天訓(xùn)練結(jié)束后添加飼料并更換飲用水，定期更換墊料、鼠籠，以保持大鼠飼養(yǎng)環(huán)境衛(wèi)生、清潔，相對濕度為50%～55%，溫度為（24±3）℃。

1.2 運動方案

對照組（C組）：正常飼養(yǎng)，但不進行任何運動干預(yù)。游泳組（S組）：游泳訓(xùn)練池大小為50×60×50（長×寬×高，cm），水深40 cm，水溫（20±2）℃。大鼠前3天游泳運動18 min/天，以后第1周游泳運動30 min/天，第2周開始每天游泳運動50 min，第3周開始每天游泳運動60 min，每周訓(xùn)練6天。跑臺運動組（R組）：大鼠前3天跑臺運動18 min/天，以后第1周跑臺運動30 min/天，第2周開始每天跑臺運動50 min，第3周開始每天跑臺運動60 min，每周訓(xùn)練6天，跑速為1.2 Km/h，跑臺坡度為0°。下跳運動組（D）：前3天跳躍運動18 min/天，以后第1周天跳躍運動30 min/天，第2周開始每天跳躍運動50 min，第3周開始每天跳躍運動60 min，每周訓(xùn)練6天，下跳高度為20 cm，頻率為7～8次/min。對于4周齡的SD大鼠，游泳60 min左右會容易導(dǎo)致其力竭沉入水底溺死，60 min（20 m/min）的跑臺運動屬于高強度運動，60 min下跳運動（高度為20 cm，頻率為7～8次/min）也屬于高強度運動，隨著3天的適應(yīng)性訓(xùn)練和第1周30 min、第2周50 min的訓(xùn)練，大鼠年齡增至6周，到訓(xùn)練結(jié)束時各組大概達到此年齡階段的中等運動強度（李良等，2018；許杰等，2018；Flores et al.，2006）。6周的訓(xùn)練結(jié)束后，進行后續(xù)實驗。

1.3 實驗動物取材

取各組大鼠后左肢骨（去軟組織），放置PBS，用4%多聚甲醛固定，然后脫鈣4周，脫鈣后進行石蠟包埋、切片，然后進行HE染色，檢測軟骨細胞數(shù)量及分布，顯示生長板軟骨細胞的組織形態(tài)，用IPP測量生長板靜息層、增殖層、肥大層及生長板的總厚度及各層百分比。

1.4 脛骨和股骨的長度和圍度指標測試

訓(xùn)練結(jié)束后，將各組大鼠立即處死，取后肢脛骨和股骨，并左右分開，將肌肉和其他韌帶組織剝離干凈，并用電子秤進行稱重，用游標卡尺測量脛骨和股骨的長骨和最細部位矢狀面的厚度，進行數(shù)據(jù)記錄和統(tǒng)計分析。

1.5 HE染色

將各組大鼠處死，在股骨頭關(guān)節(jié)處脫臼取下其左側(cè)后肢骨，剔除干凈股骨和脛骨上附著的肌肉和韌帶。然后浸入PBS中清洗2遍干凈后，放置在4% PFA（50 mL EP管）溶液中，4℃冰箱固定過夜。然后再將10% EDTA溶液加入EP管中，進行20天的脫鈣處理后進行石蠟包埋，切片。將石蠟切片在烤片機上（62℃）烤干（2～3 h）。二甲苯 II、二甲苯 I透明各 5 min，100%、95%、85%、75%、50%酒精復(fù)水各2 min，蘇木精染色30 s。流水清洗2 min或觀測沖洗的水變得無色即可，將切片放入染缸中，將染缸置于水龍頭下，用流水清洗其中的切片。將切片浸入1%鹽酸＋70%乙醇（1 mL濃鹽酸＋99 mL 70%乙醇）分色2～5 s（直到顏色變成粉色），以鏡檢為準，再用水洗一遍。將切片緩慢放入氨水（1 mL氨水＋1 L水的比例）返藍3～5 s，再將浸入伊紅染15～30 s，自來水清洗切片。接著100%酒精2 min，100%酒精2 min，95%酒精2 min，二甲苯I、II透明各5 min，中性樹膠封片過夜。然后在顯微鏡下拍片保存。利用Image pro plus 6.0軟件進行標尺校正后進行測量。

1.6 生長板軟骨細胞中相關(guān)細胞因子mRNA和蛋白檢測

取生長板軟骨放入液氮預(yù)冷過的研缽中進行研磨，提取RNA，然后反轉(zhuǎn)錄為cDNA，用SYBR熒光定量對TGFβ/BMP信號及下游基因進行檢測，引物由Primer Premier 5軟件設(shè)計（表1），由博尚生物科技有限公司合成。蛋白提取加裂解液研磨，然后移入EP管中冰上放15 min，4℃離心10 min，取上清，加入等體積loading buffer 100℃解構(gòu)，加樣，待loading buffer跑至底部，切膠轉(zhuǎn)膜，待轉(zhuǎn)好后用麗春紅染帶，用PBS洗3遍，剪膜標記目的蛋白，放入暗盒用5%的脫脂奶粉封閉1 h，然后加入目的蛋白一抗4℃過夜，用PBST洗5 min/3遍，加入相應(yīng)的二抗2 h，再用PBST洗15 min/3遍，最后掃膜，用ImageJ軟件進行灰度值分析。抗體分別購于abcam和CST公司。

表1 引物序列Table 1 List of Primer Sequences

1.7 數(shù)據(jù)處理

所有實驗數(shù)據(jù)用Excel 2010和IBM SPSS 19.0進行統(tǒng)計和分析，所有數(shù)據(jù)均用M±SD（平均值±標準差）表示，統(tǒng)計分析均采用單因素ANOVA方差分析。*表示與C組比較，P＜0.05有顯著性差異，**表示P＜0.01，有非常顯著性差異；#表示與S組比較，P＜0.05有顯著性差異，##表示P＜0.01，有非常顯著性差異；&表示與R組比較，P＜0.05有顯著性差異，&&表示P＜0.01，有非常顯著性差異。

2 實驗結(jié)果

2.1 不同方式運動后生長期大鼠后肢長度、圍度比較

本研究發(fā)現(xiàn)（圖1，表2），脛骨長度與C組和S組相比，R組和D組都非常顯著性增加（P＜0.01）；股骨長度與C組和S組相比，R組和D組都非常顯著性增加（P＜0.01）。

圖1 不同方式運動后大鼠脛骨、股骨長度和圍度指標示意圖Figure 1. ASketch Map of the Length and Dimension of the Tibia and Femur of Rats after Different Ways of Exercise

表2 不同方式運動后大鼠脛骨、股骨長度和圍度比較Table 2 Comparison of Length and Dimension of Tibia and Femur in Rats after Different Ways of Exercise n=12

2.2 不同方式運動后生長期大鼠生長板寬度比較

本研究發(fā)現(xiàn)，不同方式運動后，組間生長板的靜息層寬度無顯著性差異（P＞0.05）；增殖層寬度也無顯著性差異（P＞0.05）；肥大層寬度只有D組與C組和S組相比，有非常顯著性增加（P＜0.01），R組雖有增加趨勢但無顯著性差異（P＞0.05）；生長板的總寬度組間沒有統(tǒng)計學(xué)意義（圖2）。靜息層占生長板總寬度百分比與C組比較，S組無差異性，與C組和S組相比，R組和D組均非常顯著性下降（P＜0.01）；增殖層占生長板總寬度百分比組間無顯著性差異（P＞0.05）；生長板的肥大層占生長板總寬度百分比與C組比較，S組無差異，與C組和S組相比，R組和D組都非常顯著性增加（P＜0.01，表3）。

圖2 不同方式運動后大鼠生長板各層寬度指標比較Figure 2. The Comparison of the Width Index of Each Layer of the Growth Plate of Rats after Different Ways of Exercise

表3 不同方式運動后大鼠生長板各層寬度指標比較Table 3 Comparison of the Width Index of Each Layer of Rat Growth Plate after Different Ways of Exercise n=6

2.3 不同方式運動后生長期大鼠生長板肥大細胞數(shù)比較

與C組相比，S組的生長板肥大軟骨細胞無顯著性差異（P＞0.05），R組顯著性增加（P＜0.05），D組非常顯著性增加（P＜0.01）。與S組相比，R組和D組的都非常顯著性增加（P＜0.01，圖3，表4）。

表4 不同方式運動后大鼠生長板肥大軟骨細胞數(shù)比較Table 4 Comparison of the Number of Hypertrophic Chondrocytes in the Growth Plate of Rats after Different Ways of Exercise n=6

2.4 不同方式運動對TGFβ/BMP信號通路的影響

2.4.1 不同方式運動后TGFβ/BMP信號通路相關(guān)mRNA表達比較

本研究發(fā)現(xiàn)，BMP2 mRNA的表達水平與C組相比，S組無顯著性差異（P＞0.05），R組和D組都非常顯著性上調(diào)（P＜0.01），D組與R組相比，也顯著性上調(diào)（P＜0.05）；Smad1 mRNA的表達水平只有D組與C組和S組相比顯著性上調(diào)（P＜0.05）；Smad5 mRNA的表達水平與C組相比，S組無顯著性差異（P＞0.05），R組和D組都顯著性上調(diào)（P＜0.05）；Smad8 mRNA的表達水平與C組相比，S組無顯著性差異（P＞0.05），R組和D組都非常顯著性上調(diào)（P＜0.01）；TGFβ1 mRNA的表達水平與C組相比，S組的無顯著性差異（P＞0.05），R組和D組都非常顯著性下降（P＜0.01），與S組相比，R組和D組的顯著性下降（P＜0.05）；Smad2 mRNA的表達水平，只有D組與C組和S組相比有顯著性下降（P＜0.05），R組雖也降低但無顯著性差異（P＞0.05，表5）。

表5 TGFβ/BMP信號通路mRNA表達的比較Table 5 Comparison of the Expression of mRNAin TGFβ/BMP Signaling Pathway

2.4.2 不同方式運動后TGFβ/BMP信號通路相關(guān)蛋白表達比較

本研究發(fā)現(xiàn)，BMP2蛋白的表達水平與C組相比，S組無顯著性差異（P＞0.05），R組和D組都非常顯著性增加（P＜0.01）；Smad1蛋白的表達水平與對照組C組相比，S組的無顯著性差異（P＞0.05），R組和D組顯著性增加（P＜0.05），與S組相比，R組和D組非常顯著性增加（P＜0.01）；TGFβ1蛋白的表達水平與C組相比，S組的無顯著性差異（P＞0.05），R組和D組的非常顯著性降低（P＜0.01），與S組相比，R組的顯著性降低（P＜0.05），D組的非常顯著性降低（P＜0.01，圖4，表6）。

圖4 不同方式運動后大鼠TGFβ/BMP相關(guān)蛋白表達比較Figure 4. Comparison of Expression of TGFβ/BMPProtein after Different Ways of Exercise

表6 TGFβ/BMP蛋白表達比較Table 6 Comparison of Expression of TGFβ/BMPProtein

3 分析與討論

3.1 不同方式的運動對大鼠后肢骨長度的影響

運動作為一種非常有效的刺激方式，來調(diào)節(jié)或促進身高的增加，這一點已在運動科學(xué)領(lǐng)域被證實。運動對身高確實是有非常重要的作用，但運動方式非常重要，并不是所有運動都會對四肢的增加有顯著性的作用。羅冬梅（2002）的研究中發(fā)現(xiàn)，低強度的運動能改善生長期SD大鼠脛骨的長度和PTHrP mRNA的表達，負重和懸吊不利于大鼠骨長度的增加，但對此沒有進一步的機制研究。而房冬梅（2007）的研究發(fā)現(xiàn)，持續(xù)跑臺、持續(xù)游泳和間歇性跑臺運動都有利于骨的礦化，但游泳對長骨生長的作用小于持續(xù)跑臺運動，此結(jié)論和本實驗一致。從本實驗的結(jié)果來看，跑臺和下跳方式的運動對大鼠后肢脛骨和股骨長度產(chǎn)生了非常顯著性的影響。羅冬梅采用的是負重運動模型，而本實驗室采用的是游泳、跑步和下跳模型，這3種運動主要是后肢用力，所以實驗也是以后肢作為主要研究部位。測試之后發(fā)現(xiàn)，R組和D組的后肢脛骨和股骨長度相比C組和S組都有非常顯著性增加；而R組和D組之間，C組和S組之間無顯著性差異，這就說明，游泳運動對大鼠后肢長長作用不大，而跑臺運動和跳躍運動對生長期大鼠后肢的增長是非常有利的。

3.2 不同方式運動對生長期大鼠生長板寬度的影響

兒童青少年時期是人體軟骨內(nèi)成骨實現(xiàn)骨生長的關(guān)鍵時期，生長板是兒童青少年時期特有的組織結(jié)構(gòu)，在這一時期骨生長中，是通過生長板軟骨細胞的不斷增殖、肥大和礦化來保證骨骼的縱向生長有條不紊地進行。生長板是人體四肢縱向生長的主要結(jié)構(gòu)，其結(jié)構(gòu)和功能的變化，最終反映到身高上面。很多學(xué)者對此進行了研究，但大多都在生物和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，在運動科學(xué)領(lǐng)域很少，而且鮮見對生長板的不同層的寬度百分比進行統(tǒng)計分析。本實驗對生長板的不同層寬度進行了數(shù)據(jù)分析，而且在細胞層面進行了更為深入的探討，從影響其差異變化可能的各層百分比進行了研究。

生長板作為一種特殊的組織結(jié)構(gòu)，可以借助HE染色在生長板細胞組織學(xué)中清晰觀察，反映生長板組織學(xué)形態(tài)特征。生長板包括靜息層軟骨細胞、增殖層軟骨細胞和肥大層軟骨細胞三層，各層結(jié)構(gòu)特點為：靜息層軟骨細胞體積小，呈圓點狀，細胞數(shù)量少；增殖層軟骨細胞呈扁平鐵餅狀，細胞數(shù)量多；肥大層軟骨細胞體積最大，顏色發(fā)亮，與增殖層軟骨細胞明顯不同。

不同方式運動的力學(xué)刺激會通過生長板促進或抑制生長，因此，不同方式運動的力學(xué)刺激促進或抑制生長板生長的關(guān)系值得重視。研究發(fā)現(xiàn)，力學(xué)刺激能夠影響生長期骨的縱向生長（Gkiatas et al.，2015；O’Conor et al.，2013；Rolfe et al.，2013）。但是這種力學(xué)刺激有個“閾值”，Ehrlich等（1972）研究發(fā)現(xiàn)，力學(xué)刺激強度過高可能會導(dǎo)致生長板過快的老化或生長停止，而無法實現(xiàn)追趕生長導(dǎo)致生長板狹窄。Troib等（2015）研究發(fā)現(xiàn)，跑臺訓(xùn)練結(jié)合生長激素（growth hormone，GH），能促進CKD大鼠脛骨線狀生長，而且對小梁骨形成顯示出有益的效果，優(yōu)于GH單獨治療，說明合理的負荷有利于骨骼的縱向生長，過低或者過高的負荷反而對骨骼的縱向生長不利。Huang等（2002）的研究發(fā)現(xiàn)，大鼠進行跑臺訓(xùn)練后，生長板各層軟骨細胞數(shù)量、生長板總寬度與未運動組不具有統(tǒng)計學(xué)意義。Niehoff等（2004）、喬盼迪等（2016）研究也發(fā)現(xiàn)，無論高強度還是低強度運動，生長板中增殖層寬度與不運動組相比均顯著性降低。這個可能與實驗動物年齡和運動方式有關(guān)，選擇的大鼠年齡大，運動訓(xùn)練結(jié)束后已經(jīng)超過成年的18周，隨著年齡的增加、衰老導(dǎo)致肥大層寬度和生長板總寬度降低，運動強度過大也會加速生長板的衰老和退化，導(dǎo)致肥大層寬度和生長板總寬度降低。

本實驗采用不同方式的運動，通過生長板組織染色，對生長板的靜息層、增殖層、肥大層及生長板各層相加計算出生長板總的寬度，以及各層在總寬度所占百分比的數(shù)據(jù)統(tǒng)計，來探討運動對于生長板軟骨內(nèi)成骨的影響。研究發(fā)現(xiàn)，不同方式運動組與對照組相比生長板靜息層沒有統(tǒng)計學(xué)意義，增殖層也沒有統(tǒng)計學(xué)意義，但肥大層S組和R組與對照組相比沒有統(tǒng)計學(xué)意義，但D組與C組和S組相比非常顯著性增加，與R組沒有顯著性差異，生長板總寬度也沒有統(tǒng)計學(xué)意義；緊接著對各層占總寬度百分比進行統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，靜息層所占百分比出現(xiàn)了統(tǒng)計學(xué)意義，R組、D組和C組、S組比較都顯著性降低，但增殖層所占百分比沒有出現(xiàn)差異，肥大層所占百分比R組、D組也顯著性增加。簡單地說就是跑臺運動和下跳運動后生長板靜息層寬度變化沒有統(tǒng)計學(xué)意義，但所占生長板總長度百分比出現(xiàn)統(tǒng)計學(xué)意義，表明跑臺運動和下跳運動導(dǎo)致靜息層的下降，但增殖層都沒有統(tǒng)計學(xué)意義，而肥大層出現(xiàn)顯著上升。不同方式的運動的力學(xué)刺激不同，導(dǎo)致生長板軟骨細胞各層產(chǎn)生了不同的變化，出現(xiàn)上述現(xiàn)象的原因可能有以下幾方面：1）靜息層骨細胞數(shù)量減少，可能由于跑臺運動和下跳運動生長板軟骨細胞增值率增加導(dǎo)致；2）既然增值率增加，增殖層寬度理論上應(yīng)該增加，但是沒有發(fā)生變化，可能是由于肥大速率加快導(dǎo)致增殖速率被抵消；3）跑臺運動和下跳運動可能確實能促進軟骨細胞的肥大成熟，使得生長板軟骨細胞肥大速率增加。

3.3 不同方式運動對大鼠生長板肥大軟骨細胞數(shù)量的影響

生長板軟骨細胞肥大化的程度，在很大程度上決定了長骨的增長速率。在同齡大鼠中，生長板軟骨細胞肥大個數(shù)越多，說明細胞成熟的越多，生長板在長骨縱向生長過程中發(fā)揮的作用、貢獻也就越高。本研究發(fā)現(xiàn)，R組和D組生長板肥大軟骨細胞的數(shù)量都出現(xiàn)明顯增多，肥大細胞數(shù)量的增多也就意味著肥大軟骨細胞層面積的增加，這與前面統(tǒng)計得出的R組和D組后肢股骨生長板肥大層寬度和肥大層百分比顯著性增加是一致的，說明跑臺運動和下跳運動能促進生長板軟骨細胞的肥大，有利于軟骨內(nèi)成骨，促進骨的縱向生長。

3.4 不同方式運動對生長期大鼠生長板TGFβ/BMP信號通路的影響

BMP在調(diào)控軟骨細胞分化成熟中作用不盡相同。研究發(fā)現(xiàn)，BMP2有促進軟骨細胞增殖、肥大的作用，在軟骨修復(fù)和骨折恢復(fù)治療領(lǐng)域應(yīng)用比較廣泛，由于BMP2在骨修復(fù)過程中既有促進合成代謝，又有促進分解代謝的作用，所以已被允許用于脊椎融合及長骨腔骨的急性開放性治療。尤其在修復(fù)治療長骨缺損中，BMP2能促進骨吸收，加速骨的重建（Tannoury et al.，2014）。在軟骨內(nèi)成骨過程中也同樣具有促進軟骨內(nèi)成骨的作用。但BMP4作用正好與其相反，在體內(nèi)、外的研究發(fā)現(xiàn)，BMP4可促進MSC分泌Col2及蛋白聚糖，促進MSC向軟骨細胞分化，同時又抑制軟骨細胞肥大（Pregizer et al.，2015）。目前，比較不同運動方式通過調(diào)節(jié)BMP來調(diào)節(jié)軟骨細胞的分化和軟骨內(nèi)成骨的研究還較少。

體內(nèi)和體外的研究發(fā)現(xiàn)，BMP能誘導(dǎo)軟骨細胞的增殖，增加骨的元素，如果缺失BMP信號通路或者過表達BMP的拮抗劑，或者顯性抑制BMP受體的形成，都會降低骨骼的縱向生長。已經(jīng)證明，BMP信號通路和Ihh信號通路有幾個階段是相互影響并調(diào)節(jié)軟骨細胞發(fā)育的，同時平行調(diào)控軟骨細胞的增殖。BMP又誘導(dǎo)細胞釋放Ihh，直接調(diào)控軟骨細胞發(fā)生肥大。此外，軟骨細胞的肥大過程獨立于Ihh/PTHrP信號通路，受BMP信號通路的負調(diào)控促進軟骨細胞增殖（Minina et al.，2002），并通過負反饋循環(huán)與Ihh/PTHrP一起調(diào)節(jié)軟骨細胞的增殖成熟（Salazar et al.，2016）。

BMPI型受體有兩種，包括：BMPRA1和BMPRB1，可以激活磷酸化同樣的下游信號通路Smad1、5、8（Presley et al.，2017；Wan et al.，2005），即使 PTHrP存在時，BMP也能導(dǎo)致Ihh的高表達，Ihh信號通路在生長板軟骨細胞成熟階段不依賴于BMP的調(diào)節(jié)，Ihh的表達貫穿于生長板軟骨細胞成熟的始終，BMP在Ihh的表達上起著重要的調(diào)節(jié)作用，高水平的BMP必然在下游信號通路Smad1、5、8調(diào)節(jié)軟骨細胞成熟方面引起Ihh的升高（Ma et al.，2013），PTHrP通過調(diào)控BMP信號通路調(diào)控Ihh的表達，PTHrP負調(diào)控Ihh不一定是直接的，可能通過BMP信號通路（Grimsrud et al.，2010）。還有其他一些機制如胞外的粘合蛋白會抑制胞內(nèi)信號通路如BMP，這些信號通路間的復(fù)雜平衡一起調(diào)節(jié)骨的形成和骨的縱向生長（Estrada et al.，2013；Luo，2016；Zhang et al.，2017）。

生長板軟骨通過一個程序性的細胞增殖、肥大、分化、鈣化、凋亡，最終被骨取代。TGFβ信號被轉(zhuǎn)移到細胞核內(nèi)調(diào)節(jié)Smads信號。Smad1、5、8對BMP信號通路起作用，Smad2、3對TGFβ信號通路起作用。Smad3功能的缺失會導(dǎo)致T細胞對TGFβ響應(yīng)降低。Smad3在發(fā)育階段不會影響軟骨的形成，但在3～4周的Smad3-/-小鼠發(fā)現(xiàn)生長板肥大帶逐漸增加，這個表型在5～6周的成熟小鼠變得更加明顯，這說明Smad3的缺失導(dǎo)致生長板軟骨細胞的肥大分化。研究還發(fā)現(xiàn)，在Smad3-/-小鼠生長板Col10表達增加，蛋白多糖含量下降，而且TGFβ1處理的小鼠抑制軟骨細胞的肥大而不是Smad3-/-，說明TGFβ1在抑制軟骨細胞的肥大分化方面作用是大于Smad3的。

本實驗的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，和C組比較，S組BMP/Smad1、5、8信號通路未發(fā)生顯著性變化，而R組和D組發(fā)生顯著性變化，而且在mRNA水平D組BMP2較R組也有顯著性差異，這兩種方式的運動通過BMP信號通路作用于下游Smad1、5、8，促進了軟骨細胞肥大和礦化階段Col10和MMP13的表達，進而反映這兩種方式促進了生長板軟骨細胞的增殖和肥大，但由于僅在Smad8蛋白上D組較R組出現(xiàn)顯著性差異，還不能說明D組較R組的運動方式更有利于軟骨內(nèi)成骨。有報道發(fā)現(xiàn)，BMP的上升有利于骨量的增加，但在本研究可能是多條信號通路共同作用的結(jié)果。而且TGFβ1在mRNA水平和蛋白水平都在R組和D組較C組和S組出現(xiàn)了顯著性差異，而S組和C組之間無統(tǒng)計學(xué)意義，說明游泳運動對軟骨細胞的肥大作用不是很有效，和生長板數(shù)據(jù)統(tǒng)計結(jié)果一致。R組和D組的顯著性下降可能與生長板軟骨細胞的肥大和肥大層寬度增加有關(guān)，且蛋白表達上D組較R組出現(xiàn)的下降更為顯著，這些效果的累加，也是可能導(dǎo)致Runx2顯著升高的原因，最終導(dǎo)致軟骨內(nèi)成骨加強，骨的縱向生長明顯。

4 結(jié)論

跑臺運動和下跳運動可能通過激活生長板軟骨細胞BMP信號通路，抑制TGFβ1信號通路，增加生長期大鼠生長板肥大層的寬度百分比和肥大軟骨細胞數(shù)量，進而促進生長期大鼠后肢骨脛骨和股骨長度，且效果優(yōu)于游泳運動。