探討卵巢上皮性癌組織中USP10與p14ARF表達及臨床預后意義

王娜，王絲雨，邢雙雙

（鄭州市第三人民醫(yī)院婦科，河南 鄭州 450000）

卵巢上皮性癌是卵巢癌中最常見的類型，其發(fā)病率約占卵巢惡性腫瘤的70%，死亡率占各類婦科腫瘤的首位，已嚴重威脅女性生命安全[1-2]。該疾病發(fā)病隱匿，早期癥狀不明顯，大部分患者確診時處于晚期，此時手術(shù)切除效果差，放化療治療后容易復發(fā)，嚴重影響患者預后生存率[3]。因此，探索新的生物標志物早期確診已成為目前卵巢癌治療的研究熱點。泛素特異性蛋白酶10（USP10）是一種要參與泛素依賴的蛋白質(zhì)分解代謝及泛素周期等生命過程的去泛素化酶，既往研究發(fā)現(xiàn)，USP10具有抑制腫瘤細胞生長的效果（肺癌、肝癌）[4-5]。p14ARF是新發(fā)現(xiàn)的一個抑癌基因，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展以及細胞周期、細胞凋亡方面具有重要作用（如前列腺癌）[6]。目前國內(nèi)尚未見關(guān)于USP10、p14ARF與卵巢上皮性癌預后的研究報道。因此，本次研究主要是分析卵巢上皮性癌組織中USP10與p14ARF表達及臨床預后意義，從而為卵巢上皮性癌的診治提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2014年1月至2016年1月在我院住院治療的120例卵巢上皮性癌患者作為本次研究對象。其中年齡30～72歲，平均（52.34±5.28）歲，同時按照國際婦產(chǎn)科聯(lián)合會FIGO分期標準[7]將腫瘤分為I～Ⅱ期66例，Ⅲ～Ⅳ期54例。同時收集經(jīng)術(shù)后病理檢查確診的120例癌組織標本以及120例非癌組織標本。本次研究已獲得我院醫(yī)學倫理委員會批準。納入標準：⑴術(shù)后經(jīng)病理檢查已確診為上皮性卵巢癌；⑵告知患者及家屬并簽署知情同意書；⑶術(shù)后均行常規(guī)放化療者。排除標準：⑴伴有代謝性疾病、凝血功能障礙疾病、免疫功能障礙疾病、肝腎功能障礙疾病、嚴重感染性疾病、心血管系統(tǒng)疾病；⑵合并其它腫瘤疾病者；⑶術(shù)前進行放化療或激素治療者；術(shù)后再次手術(shù)者；⑷既往精神病史者；⑸臨床資料不完整或中途退出研究者。本研究采用門診、電話、微信及上門等多種方式結(jié)合進行隨訪，隨訪時間自病理確定日開始至2021年1月30日截止，隨訪終點事件為患者死亡或腫瘤復發(fā)/轉(zhuǎn)移，隨訪時間為3～60個月。

1.2 方法

1.2.1檢測方法 采用免疫組化染色檢測本研究對象USP10、p14ARF表達水平。將切片常規(guī)地脫蠟并用含有3%過氧化氫的甲醇處理30 min，然后在室溫下將切片在正常血清（50μl/切片）中封閉10 min，并與一抗（USP10、p14ARF）或PBS液（陰性）一起孵育對照，并于4°C過夜，與生物素偶聯(lián)的二抗（50μl/節(jié)）在室溫下孵育10 min后，加入50μl鏈霉親和素過氧化物酶，然后在室溫下孵育10 min。然后根據(jù)染色強度（用顯微鏡觀察），用新鮮制備的DAB溶液處理切片3～10 min，將切片在PBS中洗滌3次（每次3 min），染色后，將切片用蘇木精復染2 min，然后用乙醇的HCl處理。將切片在水中洗滌，在乙醇中脫水，在二甲苯中透明化，用中性樹膠固定，并在光學顯微鏡下觀察。

1.2.2 結(jié)果判定[8]免疫結(jié)果由兩位副高職稱的病理醫(yī)師盲審完成，二者結(jié)果不一致時經(jīng)第三醫(yī)師判定。首先計算隨機的高倍視野（10個，×400）中陽性細胞數(shù)占腫瘤細胞總數(shù)百分比,＜5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，＞75%為4分。USP10、p14ARF陽性細胞特征分別為：USP10定位在胞漿，呈棕黃色或棕褐色顆粒；p14ARF定位于細胞質(zhì)，呈棕黃色或棕褐色顆粒。同時按照無著色計0分、黃色計1分、棕色計2分、棕褐色計3分的標準給陽性細胞染色強度計分。最后將陽性細胞百分比例與著色強度評分相乘得出最終表達評分，分為陽性表達（＞3分）和陰性表達（≤3分）。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用χ2檢驗比較USP10、p14ARF蛋白表達情況等以率（%）表示的計數(shù)資料，卵巢上皮性癌患者的生存情況采用Kaplan-Meier法估計，影響卵巢上皮性癌患者預后因素采用單因素與多因素Cox回歸模型分析探討，雙側(cè)檢驗水準α為0.05，采用IBM公司SPSS 25.0軟件進行分析。

2 結(jié)果

2.1 不同癌組織中USP10、p14ARF蛋白表達水平的比較 卵巢上皮性癌組織中USP10、p14ARF蛋白陽性表達率均明顯低于非癌組織（35.00%vs 63.33%，P＜0.05；33.33%vs 61.67%，P＜0.05），見表1、圖1-2。

圖1 USP10蛋白在卵巢上皮性癌組織中的表達情況

表1 不同癌組織中USP10、p14ARF蛋白表達水平的比較[n（%）]

2.2 USP10、p14ARF蛋白表達和卵巢上皮性癌臨床病理特征的關(guān)系 USP10、p14ARF蛋白表達與卵巢上皮性癌患者的年齡、腫瘤直徑無明顯差異（P＞0.05），但與上皮性卵巢癌的FIGO分期、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、有無腹腔積液有關(guān)（P＜0.05），見表2。

表2 USP10、p14ARF蛋白表達和卵巢上皮性癌臨床病理特征的關(guān)系

圖2 p14ARF蛋白在卵巢上皮性癌組織中的表達情況

2.3 卵巢上皮性癌患者的預后生存情況 本研究120例卵巢上皮性癌患者隨訪3～60個月，中位生存時間43個月。USP10陽性表達卵巢上皮性癌患者的中位生存時間明顯高于陰性表達患者（55月vs 28月）（χ2=20.364，P＜0.001），p14ARF陽性表達卵巢上皮性癌患者的中位生存時間明顯高于陰性表達患者（52月vs 29月）（χ2=20.415，P＜0.001）。

2.4 卵巢上皮性癌患者預后影響因素單因素分析有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、FIGO分期、有無腹腔積液、USP10表達、p14ARF表達患者的生存時間均存在明顯差異，且有淋巴轉(zhuǎn)移、FIGO分期Ⅲ～Ⅳ期、有腹腔積液、USP10陰性表達、p14ARF陰性表達患者的生存時間更短（P＜0.05），見表3。

2.5 卵巢上皮性癌患者預后影響因素多因素Cox回歸分析 將表3中有意義的變量作為自變量，進行預后多因素Cox回歸分析得出：FIGO分期Ⅲ～Ⅳ期、淋巴轉(zhuǎn)移、腹腔積液、USP10陰性表達、p14ARF陰性表達均是影響卵巢上皮性癌患者預后危險因素（P<0.05），見表4。

表3 卵巢上皮性癌預后影響因素單因素分析結(jié)果

表4 卵巢上皮性癌患者預后影響因素經(jīng)多因素Cox回歸分析

3 討論

卵巢癌是女性生殖器官常見的惡性腫瘤之一,其死亡率僅次宮頸癌，已成為當今困擾女性患者最大的婦科惡性腫瘤殺手[9]。其中上皮性卵巢癌是卵巢癌最常見的病理類型，其發(fā)病率居女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤第三位，該疾病具有早期癥狀不明顯、發(fā)病隱匿、轉(zhuǎn)移率與復發(fā)率高等特點，因此一旦確診時大多患者已發(fā)展到中晚期[10]。既往也有統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，約70%上皮性卵巢癌患者被診斷時已處于晚期[11]。雖然隨著醫(yī)學科學水平的不斷提高，卵巢癌標準術(shù)式和各種化療藥物及靶向藥物已得到不斷完善，但術(shù)后患者5年生存率依然較低。既往有統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，上皮性卵巢癌5年生存率僅為46.2%[12]。因此，面對該現(xiàn)狀，尋找上皮性卵巢癌預后指標對于卵巢癌生存率的提高一直是婦科領(lǐng)域研究的難題。

而本次研究分析卵巢上皮性癌組織中USP10與p14ARF表達及臨床預后意義，結(jié)果顯示，卵巢上皮性癌組織中USP10、p14ARF蛋白陽性表達率均明顯低于非癌組織（P<0.05），表示USP10、p14ARF在卵巢上皮性癌組織中表達降低，與疾病的生長、增殖關(guān)系密切。本研究結(jié)果顯示，USP10、p14ARF蛋白表達與上皮性卵巢癌的FIGO分期、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、有無腹腔積液有關(guān)（P<0.05），且隨著隨腫瘤FIGO分期越高，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、有腹腔積液，其表達下調(diào)，結(jié)果提示USP10、p14ARF蛋白蛋白的表達水平下調(diào)與上皮性卵巢癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。本研究經(jīng)隨訪以及單因素結(jié)果發(fā)現(xiàn)，USP10陰性表達、p14ARF陰性表達患者的生存時間更短（P＜0.05），表明USP10、p14ARF與卵巢上皮性癌預后生存時間密切相關(guān)。同時本研究經(jīng)多因素Cox分析得出：USP10陰性表達、p14ARF陰性表達均是影響卵巢上皮性癌患者預后危險因素（P＜0.05），進一步證實USP10、p14ARF與腫瘤發(fā)生、進展以及預后密切相關(guān)，可能用作評估疾病預后生物標志物。USP10是泛素特異性蛋白酶（USPs）家族的成員之一，屬于半胱氨酸蛋白酶，USP10作為一種重要的去泛素化酶，能夠通過去泛素化作用穩(wěn)定p53在細胞中的蛋白質(zhì)水平，并達到調(diào)控細胞增殖、細胞周期、細胞凋亡、自噬等過程[13-14]。既往研究發(fā)現(xiàn)，USP10蛋白表達在宮頸鱗狀細胞癌等多種腫瘤組織中下調(diào)[15]。p53是當前發(fā)現(xiàn)的與腫瘤密切相關(guān)的基因，當p53基因突變時，能夠刺激腫瘤細胞惡化與增殖，既往有研究發(fā)現(xiàn)，p53蛋白在卵巢癌細胞中表達升高[16]。p14ARF是細胞周期依賴性激酶4抑制因子家族中的一員，作為細胞周期調(diào)控因子能夠白主要與mdm2-p53復合體結(jié)合，阻斷P53蛋白降解，延長P53蛋白的半衰期，從而誘導細胞周期停滯和凋亡[17-18]。當p14ARF蛋白在卵巢癌組織中表達降低，影響p53通路信號的傳導，使其對卵巢癌細胞的生長抑制作用減弱，一定程度上促進了卵巢痛的發(fā)生、發(fā)展。

綜上所述，卵巢上皮性癌組織中USP10、p14ARF的陰性表達率高，且二者表達均與患者FIGO分期、有無轉(zhuǎn)移、有無腹腔積液有關(guān)，有望作為評估卵巢上皮性癌患者預后的有效生物標志物。