羊毛角蛋白在巰基乙酸膽堿中的溶解再生

袁久剛， 季 吉， 薛 琪， 姜 哲， 范雪榮， 高衛東

(生態紡織教育部重點實驗室(江南大學)， 江蘇 無錫 214122)

羊毛是一種利用價值極高的天然角蛋白纖維,但是只有非常少量的細羊毛能用作紡織原材料，紡織行業每年都會產生數以萬噸計的羊毛邊角料，這不僅造成角蛋白資源的浪費，還給自然環境造成較大壓力。作為一種性能高、來源廣的可再生天然大分子，角蛋白具有良好的材料力學性能和生物相容性，在生物醫用材料[1]、膜材料[2]、纖維材料[3]、可降解塑料和其他功能材料方面具有廣泛應用。若能將羊毛溶解再生得到角蛋白，其附加值將得到大幅提升。

近幾年，隨著離子液體在纖維素溶解中的廣泛應用，該體系也逐漸引起了角蛋白研究者的關注。在纖維素溶解中，離子液體的強極性可有效破壞大分子之間的氫鍵作用從而實現高分子聚合物的溶解[4-5]。對于角蛋白而言，其溶解則更具挑戰性，因為角蛋白分子間不僅含有氫鍵，而且還含有大量的二硫鍵，這在一些研究中也得到了印證。例如：謝海波等[6]首先采用咪唑離子液體實現了羊毛的溶解和再生，但是要想達到較高溶解率必須采用非常高的溶解溫度(130 ℃)以及較長的溶解時間(10 h)。之后，孫平等[7]研究了離子液體對雞毛的溶解和再生，研究發現再生雞毛角蛋白的β-折疊含量下降，同時溶解過程伴隨少量二硫鍵的破壞，但是并未進行深入研究。本課題組研究[8]指出，這是由于高溫導致的二硫鍵熱裂解所致。孫艷麗等[9]采用巰基乙醇和離子液體混合體系對羊毛進行溶解，經過巰基乙醇還原后，離子液體的溶解效率大幅提高。這些研究都說明，只有有效破壞角蛋白的二硫鍵，離子液體在角蛋白中的溶解潛能才能得到進一步釋放。

為此，本文選用一種新型的還原性離子液體——巰基乙酸膽堿對羊毛進行了溶解再生。巰基乙酸膽堿可以由巰基乙酸和氯化膽堿經簡單的中和反應得到。本文首先采用偏光顯微鏡觀察了單根羊毛纖維、皮質層和鱗片細胞在巰基乙酸膽堿中的溶解過程；繼而對原羊毛和再生角蛋白的結構性能進行了詳細分析，探究了羊毛在巰基乙酸膽堿中的溶解機制。

1 實驗部分

1.1 主要原料與儀器

羊毛纖維，直徑約為23 μm，無錫協新毛紡織股份有限公司；巰基乙酸膽堿，質量分數為95%，上海成捷離子液體有限公司。

XPV600E型電腦型偏光顯微鏡，上海比目儀器有限公司；NICOLET is10型傅里葉紅外光譜儀，美國Thermo Fisher Scientific 公司； D2PHASER型X射線衍射儀，德國 Bruker 公司；Q200型差示掃描量熱儀，美國TA公司；Mini-protean Tetro Cells 電泳系統，美國Bio-Rad伯樂公司。

1.2 羊毛預處理

稱取適量羊毛置于索氏提取器中，用丙酮抽提脫脂，48 h后采用去離子水清洗羊毛，去除殘存的丙酮，于60 ℃烘干后將羊毛纖維剪碎備用。

1.3 羊毛角蛋白提取

準確稱取一定量的脫脂羊毛，將其置于20 g巰基乙酸膽堿中，于設定溫度下磁力加熱攪拌溶解一定時間，得到黃色混合液。待混合液冷卻至室溫后，向混合液加入適量8 mol/L尿素稀釋，之后采用砂芯漏斗過濾，收集濾液后用透析袋(截留分子質量為8 000 u)透析，直至透析液電導率小于4 μS/cm時，完成透析，之后離心除去不溶性沉淀，將所獲蛋白溶液冷凍干燥，得到再生角蛋白(可溶性部分)。

1.4 溶解觀察

將單根羊毛纖維、皮質層和鱗片細胞分別置于盛有巰基乙酸膽堿的特制載玻片凹槽中，利用熱臺加熱，用數碼偏光顯微鏡觀察其溶解過程，拍照記錄。鱗片細胞及剝鱗方法參照文獻[10]。

1.5 化學結構表征

使用傅里葉變換光譜儀對樣品進行化學結構表征，采用KBr壓片法分別測試原羊毛和再生羊毛角蛋白的紅外光譜。掃描范圍為4 000～600 cm-1，分辨率為0.4 cm-1，掃描次數為32。

1.6 結晶度測試

采用X射線衍射儀對樣品進行結晶度測定，測試時取冷凍干燥后的樣品平鋪在晶片表面。測試條件：Cu靶，工作電壓為30 kV，工作電流為10 mA，掃描范圍為5°～50°，步長為0.02 (°)/min。

1.7 熱力學性能測試

采用差示掃描量熱儀對樣品進行熱力學性能分析。分別將干燥的原羊毛和再生羊毛角蛋白放入鋁坩堝中，氮氣氣氛下進行測試，30 ℃下平衡5 min，測試溫度為30～280 ℃，升溫速率為10 ℃/min。

1.8 蛋白質分子質量測試

采用電泳系統，利用十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)方法對樣品的分子質量進行測試，SDS-PAGE凝膠質量分數為12%，標準蛋白指示劑為10～270 ku。

2 結果與討論

2.1 羊毛在巰基乙酸膽堿中的溶解速率

圖1示出在120 ℃下不同時間羊毛在巰基乙酸膽堿中溶解質量分數。可以看出，巰基乙酸膽堿對羊毛的溶解性能非常高，在前100 min內，其溶解質量分數就能達到5%。隨溶解時間逐漸增加，溶解羊毛后的巰基乙酸膽堿體系黏度也逐漸變大，因此對羊毛的溶解速度逐漸降低，當溶解時間為800 min時，其最高溶解質量分數接近16%。

2.2 溶解過程分析

圖2示出在120 ℃ 條件下整根羊毛在巰基乙酸膽堿中的溶解過程。可看出，羊毛纖維在巰基乙酸膽堿中溶解時，首先發生鱗片層的溶脹(見圖2(a)～(b))，隨后是皮質層的溶脹(見圖2(c))，進而巰基乙酸膽堿逐漸穿透進入羊毛內部，纖維晶區逐漸被破壞，變得透明，偏光慢慢消失，說明皮質層發生溶解(見圖2(d))。整個過程鱗片層和皮質層的溶解同時發生，鱗片層首先被完全溶解，隨后皮質層也被徹底溶解，羊毛結構完全消失，角蛋白溶出，視野呈現均一的透明體系(見圖2(f))，溶解過程大約需要15 min。

圖2 羊毛纖維在巰基乙酸膽堿中溶解過程

由于羊毛的鱗片層結構致密，富含二硫鍵，多數情況下，鱗片層對羊毛的溶解都會起到強烈的阻礙作用。為此，根據文獻[10]的方法將鱗片與皮質層分離后分別研究鱗片層和皮質層在巰基乙酸膽堿中的溶解過程，結果如圖3、4所示。

圖3 皮質層在巰基乙酸膽堿中溶解過程

從圖3可看出，鱗片剝除后的羊毛皮質層在溶解時不再發生明顯的溶脹現象，隨著溶解的進行，纖維直徑逐漸變細，直至完全溶解消失。這表明巰基乙酸膽堿是皮質層的真溶劑，整個溶解由表及里進行，鱗片剝除后的皮質層溶解速度更快，整個溶解過程僅需要8～10 min。

圖4 鱗片層在巰基乙酸膽堿中溶解過程

從圖4可發現，隨著溶解的進行，鱗片也出現了逐漸變小的現象(見圖4(a)、(b))，溶脹不明顯。這可能是由于采用甲酸剝除鱗片時，作用時間較長，甲酸對鱗片產生了一定的溶脹作用，并且巰基乙酸膽堿具有較強破壞二硫鍵的作用，導致鱗片結構也能夠被快速溶解；此外，在鱗片溶解的同時，視野中出現了許多小氣泡(見圖4(c)～(e)中的黑點)，直至最后鱗片完全消失時，棕褐色氣泡仍然存在。采用醋酸鉛試紙檢測時，試紙變黑，初步推測是由于二硫鍵斷裂產生了硫化氫氣體[11]。

綜合圖2～4可發現，鱗片存在時，單根羊毛纖維在溶解時存在明顯的溶脹現象，而當鱗片剝除后，溶脹現象基本消失，皮質層的溶解速率明顯加快，這說明鱗片對纖維的溶解起到了較強的阻礙作用。當鱗片覆蓋在纖維表面的時候，部分巰基乙酸膽堿通過鱗片間隙滲透進入皮質層，導致皮質層蛋白發生快速溶解;但是由于鱗片的溶解速度較慢，因此，在外層鱗片的束縛下，最終出現了溶脹現象。

2.3 再生角蛋白化學結構分析

圖5示出原羊毛和不同溫度下再生角蛋白的紅外光譜圖。可看出，羊毛是典型的蛋白質纖維，其紅外譜圖中有4個典型的酰胺鍵吸收峰，酰胺A帶(3 300～3 290 cm-1區域)、酰胺I帶(1 650 cm-1處)、酰胺Ⅱ帶(1 540～1 530 cm-1區域)以及酰胺Ⅲ帶(1 243～1 237 cm-1區域)[12]。不同溫度下溶解再生的角蛋白紅外譜圖與原羊毛非常相似，表明溶解過程中角蛋白的主鏈結構得到完好地保留。此外，再生角蛋白在1 058和980 cm-1處出現了較強的特征吸收峰。該處為S—O伸縮振動峰，這是由于溶解過程中，原羊毛中胱氨酸的二硫鍵被巰基乙酸膽堿還原形成了巰基，但是在高溫條件下巰基又被空氣中的氧氣快速氧化，最終成為半胱氨酸氧化物。

圖5 原羊毛及再生角蛋白紅外光譜圖

2.4 再生角蛋白結晶度分析

圖6為原羊毛和再生角蛋白的X射線衍射譜圖。可看到，羊毛及再生角蛋白均存在2θ在9°及20°附近的特征峰，其中，2θ=9°的峰主要由α-螺旋引起，2θ=20°附近的峰則主要由β-折疊引起。與原羊毛相比，再生角蛋白在2θ=9°附近特征峰強度明顯下降，2θ=20°附近特征峰強度升高，說明溶解得到的可溶性再生角蛋白的α-螺旋結構減少，β-折疊結構增加。

圖6 羊毛及再生角蛋白的X射線衍射圖譜

為進一步說明角蛋白結晶度隨溶解溫度的變化，采用L-SEGAL建立的方法[13]，計算原羊毛與再生角蛋白的結晶指數CI，結果見表1。計算公式為

CI=(I9-I14)/I9

式中：I9為2θ等于9°處最強衍射峰強度；I14為2θ等于14°處最小衍射峰強度。

表1 羊毛及再生角蛋白結晶指數

由表1可看出，相較于原羊毛，可溶性再生角蛋白結晶指數降低較多。隨著溶解溫度的增加，結晶指數逐漸下降，其原因可能是高溫條件下角蛋白大分子發生了一定程度的降解，以及一部分非可溶性大分子角蛋白在透析時被去除，從而引起結晶度下降。

2.5 再生角蛋白熱性能分析

分別對原羊毛和不同溫度下再生角蛋白進行差示掃描量熱分析，結果如圖7所示。

圖7 再生角蛋白差示掃描量熱圖

由圖7可看出，原羊毛和再生角蛋白都有2個明顯的吸熱峰。一個是介于125～155 ℃的結合水吸熱峰；另一個是200～250 ℃附近的α-螺旋解折疊和基質胱氨酸分解雙吸熱峰[14-18]。再生角蛋白的結合水吸熱峰后移，這是因為溶解再生后，通過透析主要得到的是一些可溶性角蛋白，其親水性增加，氫鍵結合能提高所致。200～250 ℃附近的雙吸熱峰隨著溶解溫度的提高，吸熱峰面積越低，這說明羊毛在巰基乙酸膽堿溶解時，其α-螺旋結構被破壞，再生后角蛋白中的α-螺旋結構無法恢復。

2.6 再生角蛋白的分子質量分析

圖8示出原羊毛和再生角蛋白的電泳分析結果。可看到，原羊毛角蛋白在10～160 ku 的分子質量范圍均有分布。相較于原羊毛，再生角蛋白分子質量發生了不同程度的降低。再生角蛋白分子質量大部分集中在10～40 ku之間，在大于40 ku區域內，b組條帶最深，其次是c組，d組幾乎無條帶出現。這說明溶解過程伴隨著角蛋白大分子的降解，同時由于一部分非可溶性大分子角蛋白在透析時被去除，導致產物的分子質量下降。并且溶解溫度對再生角蛋白分子質量影響較大，溫度越高，再生角蛋白分子質量越低。

a—標準蛋白；b—再生角蛋白(110 ℃)； c—再生角蛋白(120 ℃)；d—再生角蛋白(130 ℃)；e—原羊毛。

3 結 論

巰基乙酸膽堿是羊毛的優良溶劑，能夠高效還原二硫鍵，對阻礙溶解的致密鱗片層有較強的破壞作用，因此可以快速溶解羊毛纖維。經巰基乙酸膽堿溶解再生的角蛋白保留了完整的蛋白質大分子主鏈結構，分子質量介于10～40 ku之間，但結晶度和α-螺旋結構含量都有所降低，長時間的高溫溶解也會導致蛋白大分子降解;因此在利用巰基乙酸膽堿溶解角蛋白的過程中需要嚴格控制溶解溫度和溶解時間。