查爾酮衍生物DL32對脂多糖誘導的大鼠急性肺損傷的影響

董利利 湯昱 李敏 陳超輝 王靜 張亞利 張磊

急性肺損傷（Acute lung injury，ALI）/急性呼吸窘迫綜合征（Acute respiratory distress syndrome，ARDS）是機體在各種致傷因素（如嚴重感染、休克、創傷等）作用下，肺內大量炎癥細胞浸潤和滲出、肺泡上皮細胞及肺泡毛細血管內皮屏障損傷造成的非心源性肺水腫，進而出現進行性低氧血癥和呼吸困難等癥狀[1，2]。ALI/ARDS是臨床常見的急危重癥，發病急驟，盡管呼吸支持技術不斷進步、對分子機制了解逐步深入，病死率仍高達35%～46%[1，3]，且對本病目前尚無特異的治療方法，因此，探索新型藥物防治ALI/ARDS是臨床治療的迫切需要。

細菌感染是ALI/ARDS 最常見的致病因素，其中又以革蘭陰性細菌內毒素為主導，脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）是內毒素的主要活性成分，采用氣管注射LPS是目前常用的制備ALI/ARDS 動物模型的方法且已經廣泛應用于ALI 發病機理和藥物防治等臨床前研究[4]。

在生物體內，LPS 首先被LPS 結合蛋白（LPS binding protein，LBP）識別并形成復合物，然后在輔助蛋白CD14 的幫助下轉運至細胞表面與Toll 樣受體4（TLR4）和髓樣分化蛋白2（Myeloid differentiated protein，MD-2）組成復合物，從而激活TLR4 依賴的炎癥信號通路[5，6]。在LPS 的識別和TLR4 跨膜信號轉導過程中，MD-2 起著至關重要的作用[5]。MD-2 含有一個容納LPS 中脂質A 的疏水性口袋，LPS 一旦侵入，TLR4/MD-2復合物受體將迅速發生二聚化形成TLR4-MD-2-LPS 復合物，招募髓樣分化因子88（Myeloid differentiation factor，MyD88）以啟動炎癥信號通路，導致炎癥級聯反應，促進炎癥因子的釋放和表達[6]，如TNF-α、IL-6、 IL-1β 和COX-2 等均在ALI/ARDS 病程進展中起重要作用[7]。

研究發現，MD-2 基因敲除的大鼠對LPS 無反應且能耐受LPS誘導的膿毒性休克[8]。目前，與MD-2 直接結合并抑制其活性的天然產物有JSH、姜黃素、黃腐酚和異黃腐酚、葛杜寧等[9]，均含有查爾酮類似結構。溫州醫科大學藥學院化學生物學研究中心長期從事藥物化學和化學生物學研究，發現在合成的查爾酮類化合物中DL32[（E）-2，3-Dimethoxy-30，40-dihydroxychalcone]具有良好的體外抗炎活性。本研究探討DL32 以ALI 大鼠為模型的體內抗炎活性及其機制。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑化合物DL32 由溫州醫科大學藥學院化學生物學研究中心合成。

LPS（Sigma，貨號L6386），動物組織蛋白抽提試劑（博士德生物技術有限公司，貨號AR0101），大鼠TNF-α ELISA 試劑盒（eBioscience，貨號85-88-7340-86），anti-TLR4 抗體（Santa Cruz Biotechnology，貨號sc-293072），anti-MD-2 抗體（Santa Cruz Biotechnology，貨號sc-80183），anti-CD68 抗體（Cell Signaling Technology，貨號76437S），實時熒光定量PCR 試劑（Invitrogen，貨號1708882AP），肺組織髓過氧化物酶（MPO）活性檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所，貨號A044），瑞士-吉姆薩染色液（南京建成生物工程研究所，貨號D010），羥甲基纖維素鈉（中國醫藥上海化學試劑公司，貨號30036328）。

1.2 儀器SpectraMax M2 酶標儀（美國 MD），電泳儀及轉膜儀、曝光儀及PCR 擴增儀（美國 Bio-rad），落地式離心機（美國 Beckman），倒置顯微鏡（日本Olympus），包埋機及切片機（德國Leica）。

1.3 動物健康雄性Sprague Dawley（SD）大鼠（6～8周齡，180～220g）購自上海斯萊克實驗動物中心，生產許可證號 SCXK（滬）2012-0005。大鼠在恒室溫、12∶12h 晝夜節律條件下飼養，自由飲水并攝食。該動物實驗經溫州醫科大學實驗動物管理委員會批準并在溫州醫科大學醫學院動物實驗中心進行[wydw2014-0001]。

1.4 方法

1.4.1 實驗分組及急性肺損傷模型建立 將SD 大鼠隨機分為空白對照組、LPS 模型組、DL32 單純給藥組、DL32 預防組4組，每組8只，連續7 天灌胃給予DL32 20mg/kg 或等量0.5%羧甲基纖維素鈉（CMCNa），各組大鼠吸入乙醚麻醉后，鈍性分離暴露氣管，LPS 模型組和DL32 預防組采用氣管滴注5mg/kg LPS 建立急性肺損傷模型，空白對照組和DL32 單純給藥組滴入等量的生理鹽水，逐層縫合傷口，24h后收取樣本。

1.4.2 支氣管肺泡灌洗液（BALF）的收集 ALI 動物模型建立24h后，大鼠腹腔注射10%的水合氯醛（5ml/kg）進行麻醉并結扎右肺，暴露氣管行氣管插管，左肺用1ml 生理鹽水進行支氣管肺泡灌洗，收集灌洗液，重復3次。

1.4.3 BALF 的蛋白濃度測定及細胞計數 將收集的BALF 4℃ 1000rpm 離心5min，取上清液檢測蛋白濃度，用50μl 生理鹽水重懸沉淀，混勻后取20μl 用細胞計數儀Standard 計數肺泡灌洗液中的總細胞數，并取10μl 做成涂片用Wright-Gimesa 染色法（按試劑盒說明書操作）計數BALF 中中性粒細胞計數。

1.4.4 肺濕重/干重比（W/D）的測定 ALI 動物模型建立24h后，取右肺上葉，濾紙吸去組織上的水分后稱取濕重，放入60℃烘箱中72h 以上，直至恒重，稱取干重，計算肺組織W/D，判斷肺水腫程度。

1.4.5 MPO 活性測定 按MPO 活性檢測試劑盒說明書進行操作。

1.4.6 BALF 中TNF-α 蛋白含量檢測 按ELISA 試劑盒檢測說明書測定BALF 上清液中TNF-α 蛋白含量。

1.4.7 實時熒光定量PCR（RT-qPCR）檢測肺組織中IL-6 及TNF-αmRNA的表達 按試劑盒說明書進行：①提取大鼠肺組織中總RNA；②將RNA 逆轉錄成cDNA；③RT-qPCR 擴增儀檢測CT值，并計算相對值。所用引物序列如下：大鼠β-actin 正義鏈5'-AAGTCCCTCACCCTCCCAAAAG-3'，大鼠β-actin 反 義鏈 5'- AAGCAATGCTGTCACCTTCCC-3'；大鼠TNF-α 正義鏈5'-TACTCCCAGGTTCTCT TCAAGG-3',大鼠TNF-α 反義鏈5'-TACTCCCAGG TTCTCTTCAAGG-3';大鼠IL-6 正義鏈5'-GAGTTG TGCAATGGCAATTC-3'，大鼠IL-6 反義鏈5'-ACTC CAGAAGACCAGAGCAG -3'。

1.4.8 蘇木素-伊紅（HE）染色 4%多聚甲醇溶液中固定肺組織，經乙醇脫水，用石蠟包埋，切成5μm薄片于載玻片上進行HE 染色。染色完成后在光學顯微鏡（200×，Nikon，Japan）下行組織病理評分。組織損傷程度評分：0分（正常）～4 分（嚴重），包括間質性炎癥、中性粒細胞浸潤、充血、組織間隙變窄和水腫[10]。

1.4.9 免疫組織化學染色檢測CD-68 肺組織經固定、脫水、包埋、切片、脫蠟和水化后，1% BSA 室溫封閉30min，滴加CD68 抗體一抗于4℃過夜，PBS洗滌3次后加入辣根過氧化酶標記的二抗，室溫孵育1h，加DAB 顯色并用蘇木素復染，中性樹脂封片，鏡檢。

1.4.10 組織免疫共沉淀 用動物組織蛋白抽提試劑提取大鼠肺組織蛋白，向300μg 蛋白中加入MD-2抗體，4℃搖床孵育過夜，然后每個樣品中分別加入20μl 蛋白A+G 磁珠收取免疫復合物并用冷的PBS洗去未被結合的蛋白，重復5次；樣品中加入緩沖液煮沸并離心后取等量樣品進行SDS-PAGE 電泳，將蛋白轉至PVDF 膜，用5%的脫脂牛奶室溫封閉1.5h，加入抗TLR4 抗體于4℃搖床過夜；0.1% TBST溶液洗膜3次后加入辣根過氧化酶標記的二抗室溫孵育1h，經ECL 孵育顯影并用化學發光凝膠成像系統成像。

1.5 統計學方法采用SPSS 19.0 軟件進行統計學分析，計量資料用均數±標準差（）表示，兩組比較采用t檢驗，P＜0.05 為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 化合物DL32緩解LPS誘導的大鼠ALI組織病理學改變LPS可造成氣道粘膜損傷，引起大鼠ALI 組織病理學改變，見圖1。而DL32 預處理的大鼠肺損傷評分明顯低于LPS 模型組（6.75±0.63 vs 13.75±0.85，t=6.60，P=0.0006），且DL32 單純給藥組與空白對照組肺損傷評分比較，差異無統計學意義（2.25±0.63 vs 3.00±0.41，t=1.00，P=0.3559）。

2.2 化合物DL32緩解LPS誘導的ALI大鼠肺W/D及BALF蛋白滲出與LPS模型組相比，DL32預處理可顯著降低肺W/D 及BALF 中蛋白濃度（t=2.930、2.507，P=0.043、0.028）；DL32 單純給藥組與空白對照組比較未見明顯變化，差異無統計學意義（t=0.499、1.930，P=0.652、0.086），見表1。

2.3 化合物DL32緩解LPS誘導的ALI大鼠炎性細胞浸潤氣管滴注LPS 24h后，免疫組化顯示CD68 陽性細胞于肺組織中大量聚集，見圖2。CD68 為巨噬細胞表面的一種特異性抗原，與LPS模型組相比，化合物DL32 預處理后能明顯減少巨噬細胞浸潤（t=6.398，P=0.001），DL32 單純給藥組與空白對照組相比，差異無統計學意義（t=0.824，P=0.441）。LPS 模型組BALF 中總細胞數及中性粒細胞數明顯增加，而經化合物DL32 預處理后，炎性細胞數量顯著減少，差異均有統計學意義（t=2.433、5.197，P=0.045、0.004），DL32 單純給藥組與空白對照組相比，差異均無統計學意義（t=0.005、2.161，P=0.996、0.083）。LPS 刺激MPO 活性的增高，DL32預處理后組織中MPO 活性明顯降低，差異有統計學意義（t=2.648，P=0.046），DL32單純給藥組與空白對照組相比，差異無統計學意義（t=0.417，P=0.698），見表2。

2.4 化合物DL32緩解LPS誘導的ALI大鼠炎癥因子的釋放氣管滴注LPS 24h后，BALF 中TNF-α 濃度明顯升高，組織中炎癥因子IL-6、TNF-α 基因表達也顯著增多，化合物DL32 預處理可顯著抑制炎癥因子的釋放和表達，差異均有統計學意義（t=3.320、25.310、7.203，P=0.030、＜0.0001、0.002），DL32 單純給藥組與空白對照組相比，差異無統計學意義（t=2.175、1.283、0.246，P=0.118、0.256、0.818），見表3。

2.5 化合物DL32抑制ALI 大鼠中TLR4/MD-2復合物的形成為進一步探討DL32緩解ALI 的靶向性，進行肺組織免疫共沉淀檢測，結果顯示，LPS 可誘導TLR4/MD-2 的大量形成，DL32 預處理則明顯減少該復合物的形成，并且DL32 單純給藥組未見明顯變化，見圖3。

圖1 化合物DL32緩解LPS誘導的大鼠ALI 結果（HE 染色，200×）

表1 肺W/D 及BALF 蛋白濃度測定

圖2 化合物DL32緩解LPS誘導的ALI 大鼠炎性細胞浸潤（CD68 免疫組化染色，200×）

表2 炎性細胞及活動測定

表3 炎癥因子測定

圖3 化合物DL32緩解LPS誘導的ALI 大鼠炎癥因子的釋放及TLR4/MD-2復合物的形成

3 討論

本研究發現，DL32 以MD-2 為靶點可緩解LPS誘導的大鼠ALI。MD-2是TLR4 的一個共同受體，它與TLR4 在細胞表面結合并介導LPS 和TLR4 的結合，促進TLR4 二聚化并激活下游信號通路從而上調炎癥因子的表達[6]。由于MD-2 可直接識別LPS 的脂質A 部分而介導TLR4 活性，在感染引起的炎癥中，MD-2是比TLR4 更具吸引力的藥物作用靶點[11]。研究發現，通過藥理學和遺傳學方法抑制MD-2 活性可使炎癥性疾病減輕，如膿毒血癥、肺炎、腎炎、哮喘、心肌炎、非酒精性脂肪肝和纖維化等[9]。腎組織中，紫杉醇與MD-2 的結合可阻斷LPS 與TLR4/MD-2 的復合，從而抑制NF-κB的活化及促炎因子的產生[12]。在大鼠體內，小干擾RNA 敲除肺MD-2 可減輕花粉和貓毛引起的過敏性炎癥反應[13]。

近年來，相繼報道的作用于MD-2 而抑制LPS與TLR4 結合的脂質類或非脂質小分子抑制劑已有幾十種[9]。其中，最具代表性的脂質類化合物Eritoran 可與LPS 競爭結合于MD-2 的位點，而與TLR4 卻沒有直接作用，但是，在膿毒癥Ⅲ期臨床實驗中，Eritoran 治療組與安慰劑組相比并無顯著差異[14]。天然產物如姜黃素、查爾酮、葛杜寧以及我們實驗室新合成化合物L6H21[15]和L48H37[16]可直接與MD-2 結合從而抑制MD-2 與LPS 結合介導的炎癥反應，具有顯著的抗炎效果，同時再次證實MD-2 在介導炎癥反應中的重要作用。本研究發現，DL32 在體內具有良好的抗炎作用。

LPS是引起ALI/ARDS 最常見的原因之一，常進展較快，氣管內滴注LPS 可以導致肺氣-血屏障受損引起毛細血管內皮細胞及肺泡上皮細胞損傷，組織學特征及病理生理變化主要表現為肺泡間隔增厚、充血、水腫、中性粒細胞及巨噬細胞浸潤聚集，氣管壁增厚、充血、水腫、杯狀細胞和粘液細胞增多、中性粒細胞及巨噬細胞浸潤聚集及炎癥介質的大量合成和釋放（TNF-α、IL-6、IL-8、IL-1β 等）[2]。然而，目前臨床上尚無有效的藥物治療且死亡率依然較高。研究發現，抑制MD-2 活性可緩解肺部炎癥，MD-2 基因敲除的大鼠經鼻滴入腦膜炎奈瑟菌來源的LPS誘導的肺炎BALF 中性粒細胞數顯著減少[17]。Zhang 等[5]研究發現，抑制MD-2 活性可減輕革蘭氏陰性細菌內毒素誘導的肺部炎癥。本研究發現，MD-2 抑制劑DL32 可顯著緩解大鼠肺水腫及減少中性粒細胞浸潤。同時，DL32 減輕了肺泡毛細血管的通透性增加及蛋白滲出并抑制了BALF及肺組織中炎癥介質的釋放。此外，肺組織中，LPS誘導促使TLR4/MD-2復合物的形成，而DL32 預處理則明顯減少該復合物的含量。因此，DL32 作為MD-2 抑制劑有望成為治療ALI 的候選藥物，而抑制MD-2 有望成為治療ALI 的新策略。

總之，本研究表明DL32 可緩解LPS誘導的大鼠ALI 且MD-2是LPS誘導的ALI 的重要治療靶點，但DL32 抑制MD-2 的具體分子作用機制有待進一步研究。