超順磁性聚乙烯亞胺納米粒的制備及其骨肉瘤細胞、組織靶向轉染效果觀察

岑超德，張永，羅聰，陳韜，楊曉蘭，曹永飛，劉承偉

1 貴州省骨科醫院，貴陽550000；2 貴陽市第一人民醫院；3 重慶醫科大學附屬兒童醫院；4 重慶醫科大學

骨肉瘤是兒童和青少年最常見的惡性骨腫瘤之一，傳統治療方法并未使患者生存率得到明顯改善［1］，基因治療的興起給骨肉瘤的治療帶來了新的希望［2-3］。基因治療的關鍵在于選擇安全有效的基因載體。由于病毒載體可引發機體炎癥反應和基因突變等，目前對非病毒載體研究較多［4］。然而，絕大部分的非病毒載體并不能很好地轉染骨肉瘤細胞，非病毒基因載體的非特異性轉染對健康細胞的毒性較大。探尋一種簡單、快速、可控的方法使治療基因進入靶細胞內高效表達對于提高基因治療的效果和特異性有重要意義。磁輔助轉染技術由于其對細胞傷害小、轉染效率高而備受研究者的青睞［5］。骨肉瘤的配體靶向治療及免疫治療是研究熱點，但價格昂貴、效果差異大［6-7］。目前，將治療基因與磁轉染結合的磁靶向基因治療技術相關報道較少。2019年8 月—2020 年8 月，本研究將低分子量聚乙烯亞胺（PEI）修飾超順磁性氧化鐵納米粒（SPION），賦予PEI 磁靶向性，制備超順磁性聚乙烯亞胺納米粒（PEI-SPION-NPs），觀察其體內外對骨肉瘤細胞和組織的靶向轉染效果。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料 雄性BALB/C 裸鼠30 只（6～8周齡，15～18 g），購自中國重慶醫科大學動物中心，飼養于IVC 無菌、溫度可控環境。 骨肉瘤細胞MG-63 和pReceiver-M29-VEGF165/DH5a 由 重 慶 醫科大學附屬兒童醫院兒科研究所905 干細胞實驗室提供。SPION、分子量為20 000 的PEI 粉末及Hoch?est33324 試 劑 購 自 美 國Sigma 公 司。 Lipo?fectamine2000 購自美國Stemcell 公司。商業化磁轉染試劑PolyMag-200、24 孔培養磁板購自Chemicell公司。EDC和NHS購自西亞試劑公司。CCK-8測試盒購自七海生物科技有限公司。RBIIC 購自上海阿拉丁試劑有限公司。Lyso-Tracker-Green DND-26 購自上海偉進生物科技有限公司。Endo-free Plasmid Max Kit25試劑盒購自美國OMEGA 公司。振動樣品磁強計及Zetasizer2000 型Zeta 電勢粒徑分析儀購自英國馬爾文公司。原子力顯微鏡由重慶大學電氣工程學院自主研發。激光共聚焦顯微鏡購自德國Leica 公司。透射電鏡購自日本Hitachi 公司。流式細胞儀購自美國BD 公司。活體成像儀購自美國Caliper公司。

1.2 PEI-SPION-NPs 的制備及表征檢測 配制PEI溶液（1 mg/mL）和SPION溶液，參照NAMGUNG 等［8］的方法制備PEI-SPION-NPs。具體方法：調節SPION溶液pH 為5，攪拌下加入EDC 0.1 g 和NHS 0.5 g 活化納米顆粒表面的羧基，然后加入等體積的PEI 溶液，室溫條件下持續攪拌4～6 h。最后經截留分子量為20 000 的透析袋持續透析2 d，收集PEI-SPIONNPs，部分冷凍干燥備用。用原子力顯微鏡分析PEI-SPION-NPs 的分子結構，透射電鏡觀察粒徑，振動樣品磁強計測飽和磁化強度，電勢粒徑測量儀測定Zeta電位。

1.3 PEI-SPION-NPs 對pDNA 結合及保護作用觀察 取適量PEI-SPION-NPs 溶液與定量pDNA（2μg）分別按N∶P 為1∶5、1∶1、5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1 及30∶1 的比例于37 ℃、5% CO2條件下混合孵育20 min。配制1% 瓊脂糖凝膠于90 mV 條件下電泳30 min，觀察PEI-SPION-NPs 的DNA 結合能力。參照上述方法，在PEI-SPION-NPs 溶液中加入1/10體積的反應緩沖液，然后加入DNase-Ⅰ（2 U/μL）2 μL于37 ℃、5% CO2條件下孵育30 min 消化pDNA。向復合物中加入EDTA 溶液至終濃度為2.5 mmol/L，65 ℃加熱10 min 使DNase-I 失活。最后，在復合物中加入肝素鈉（1 mg/mL）4 μL 并室溫放置3 h，使pDNA 從PEI-SPION-NPs 中釋放，1% 瓊脂糖凝膠電泳觀察pDNA的完整性。

1.4 PEI-SPION-NPs 對MG-63 細胞毒性作用觀察MG-63 細胞以4×103/孔接種于96 孔板中，于37 ℃、5% CO2、95% 相對濕度條件下培養直至細胞完全貼壁生長。轉染前將培養基吸走，PBS 清洗2 遍，每孔加入無添加培養基100 μL。將細胞分為4個組。實驗1 組加入無添加培養基配制的PEI-SPION-NPs/pDNA（N∶P 為10∶1）各50 μL；實 驗2 組 加 入PolyMag200/pDNA；實驗3 組加入無添加培養基配制的PEI/pDNA（N∶P 為10∶1）50 μL；對照組只加入pDNA。空白孔加入生理鹽水50 μL。實驗1組和實驗2組的培養板于磁場上作用20 min，實驗3組和對照組不經磁場作用。各組轉染4～6 h 后用100 μL 的PBS（100 mmol/L，pH 7.4）清洗2 遍，棄掉未被吞噬的復合物。每孔加入培養基總體積10% 的CCK-8溶液繼續培養2 h，用采用ELISA 法檢測450 nm 波長處的光密度（OD）值。用公式計算細胞存活率。細胞存活率=（實驗組OD 值－空白組OD 值）/（對照組OD值－空白組OD值）×100%。

1.5 PEI-SPION-NPs/pDNA 轉染MG-63 細胞觀察MG-63 細胞以3.0×105/孔接種于24 mm 的玻底皿中，加入含10% 血清培養基2 mL 于37 ℃、5% CO2、95% 相對濕度條件下培養。行示蹤實驗前1 h，將培養孔中血清培養基棄掉，加入無添加培養基1 mL。將細胞分為4 個組。實驗1 組在避光條件下每孔加入RBITC 標記的PEI-SPION-NPs 200 μL，實驗2 組加入PolyMag200/pDNA，實驗3 組加入RBITC-PEI/pDNA 200 μL，對照組只加入pDNA。實驗1 組、實驗2組給予靜磁場干預30 min，實驗3組和對照組不進行靜磁場干預。繼續培養3 h 后用PBS 清洗2 遍，加入含10% 血清新鮮培養基2 mL。分別于6、12、24 h后吸走培養基，PBS清洗2遍，用Hochest3342進行細胞核染色5 min，PBS輕輕洗滌2遍，然后加入含0.5 μmol/L LysoTracker Green DND-26 的熒光探針工作液孵育1 h，PBS 洗滌2 遍后用激光共聚焦顯微鏡在激發光與發射光波長下觀察細胞。于12 孔板中培養MG-63 細胞，分組操作參考“1.4”。轉染4～6 h后用PBS緩沖液清洗3遍，棄掉未被吞噬的納米顆粒；繼續培養至24 h，收集細胞，用流式細胞儀檢測轉染率，實驗重復3次。

1.6 PEI-SPION-NPs/pDNA 轉染裸鼠骨肉瘤組織觀察 BALB/C 裸鼠背部皮膚以碘伏消毒后，于皮下注入1.0×106個MG-63 細胞制作骨肉瘤模型，注射部位1 個月左右長成直徑為10 mm 的腫瘤包塊。將裸鼠分為Control 組、PEI-SPION-NPs 組、PEI-NPs組，每組6只。PEI-SPION-NPs組、PEI-NPs組分別向腫瘤組織內注射5% 葡萄糖溶液配制的PEI-SPIONNPs/pGL3-Luc 復合物、PEI/pGL3-Luc 復合物各100μL，Control 組向腫瘤組織內注射生理鹽水100 μL，于腫瘤表面粘貼小磁塊，磁場作用30 min（磁場強度為2 000 Gs）。48 h 后經裸鼠腹腔內注射熒光素酶底物luciferin（2 μg/μL）200 μL，異氟烷氣體麻醉裸鼠，快速用活體成像儀觀察注射部位的熒光強度。分別于造模第5、6、7、8、9周測量各組裸鼠體質量。

1.7 統計學方法 采用SPSS19.0 統計軟件。計量資料以表示，多組比較采用方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 PEI-SPION-NPs 的表征 原子力顯微鏡下，PEI-SPION-NPs 氨基基團與pDNA 脫氧核苷酸鏈中磷酸基團通過靜電吸附的方式進行結合。PEI-SPI?ON-NPs 的飽和磁化強度為（21.5 ± 1.6）emu/g，剩磁接近0.0 emu/g，說明靜磁場可促進其快速有效濃聚，而退出磁場后納米粒無磁性，不會發生團聚。透射電鏡下可見PEI-SPION-NPs呈類圓形，粒徑為（32 ±3.6）nm；而PEI-SPION-NPs/pDNA 由多個鐵核組成的不規整狀，粒徑為（115 ± 21.7）nm（圖1A、B）。PEI-SPION-NPs 的Zeta 電位為（31.2 ± 1.5）mV，可作為基因載體攜載負電荷的pDNA 轉染細胞，納米顆粒間因相同電荷而相互排斥，避免納米顆粒團聚，有利于維持其穩定性。

圖1 透射電鏡下PEI-SPION-NPs及PEI-SPION-NPs/pDNA復合物的形狀和大小

2.2 PEI-SPION-NPs 對pDNA 的結合及保護作用當N∶P 高于5∶1 時，pDNA 的條帶消失，PEI-SPIONNPs 完全結合質粒。見圖2。當N∶P 高于5∶1 時，核酸酶降解過程終止后，被PEI-SPION-NPs完全結合的pDNA 在肝素鈉作用下釋放，顯示條帶完整。PEISPION-NPs可保護pDNA不被核酸酶降解。見圖3。

圖2 PEI-SPION-NPs與pDNA結合實驗結果

圖3 PEI-SPION-NPs對pDNA的保護作用實驗結果

2.3 PEI-SPION-NPs的細胞毒性 見表1。

表1 轉染后不同時點各組MG-63細胞的存活率（%）

表1 轉染后不同時點各組MG-63細胞的存活率（%）

注：與實驗2組相比，*P＜0.05；與實驗3組相比，#P＜0.05。

組別實驗1組實驗2組實驗3組對照組細胞存活率72 h 93.38 ± 8.26*#68.13 ± 7.47 77.75 ± 6.74*98.25 ± 2.11*#24 h 90.25 ± 11.01*#60.00 ± 7.50 77.13 ± 6.41*97.63 ± 3.16*#48 h 91.13 ± 8.54*#65.63 ± 9.16 78.25 ± 3.77*97.38 ± 3.35*#

2.4 PEI-SPION-NPs/pDNA 轉 染MG-63 細 胞效果轉染后6 h，實驗1 組較實驗3 組出現較多的紅色熒光（RBITC 標記的PEI-SPION-NPs 或PEI-NPs）與綠色熒光（pDNA 表達）重疊后產生的黃色熒光區域（共定位區域）。轉染后12 h，大部分的紅色熒光從綠色熒光中擴散，出現在代表細胞核的藍色熒光區域周圍，其中實驗1 組較實驗3 組明顯［9］。轉染后24 h，可見某些細胞核中出現少許紅色熒光，細胞中綠色熒光達到高峰，實驗1組較實驗3組綠色熒光表達更強。實驗1組、實驗2組、實驗3組、對照組轉染24 h 后 轉 染 率 分 別 為18.8% ± 2.4%、17.3% ±1.3%、4.0% ± 1.2%、0.1% ± 0.05%，實驗1 組轉染效率高于實驗3組和對照組（P均＜0.05）。

2.5 PEI-SPION-NPs/pDNA 轉染裸鼠骨肉瘤組織效果 PEI-SPION-NPs/pGL3-Luc 與PEI-NPs/pGL3-Luc 均可在裸鼠骨肉瘤組織中成功轉染。PEI-SPI?ON-NPs 組較PEI-NPs 組熒光更為集中。見圖4。PEI-SPION-NPs 組和Control 組造模第5、6、7 周裸鼠體質量逐漸增長，造模第7 周體質量逐漸下降。而PEI-NPs 組造模第6 周體質量達到高峰，6 周后開始下降。造模第7 周后PEI-SPION-NPs 組裸鼠體質量高于PEI-NPs組（P均＜0.01）。見表2。

圖4 PEI-SPION-NPs/pGL3-Luc轉染裸鼠骨肉瘤組織效果

表2 造模不同時間各組裸鼠體質量比較（g，）

表2 造模不同時間各組裸鼠體質量比較（g，）

注：與造模相同時點的PEI-NPs組相比，*P＜0.01。

組別PEI-SPION-NPs組PEI-NPs組Control組體質量第9周25.20 ± 1.47*16.20 ± 1.17 26.00 ± 0.89第5周21.20 ± 1.47 21.60 ± 1.62 21.40 ± 1.02第6周25.60 ± 1.85 25.60 ± 1.02 26.20 ± 1.17第7周32.40 ± 1.96*22.60 ± 1.85 34.00 ± 0.63第8周29.20 ± 1.47*19.20 ± 2.56 30.00 ± 1.41

3 討論

骨肉瘤的治療方法主要包括外科保肢手術治療、新輔助化療、分子靶向治療及免疫治療［10］。隨著分子生物學研究進展，學者們開展了抗腫瘤血管生成、促進腫瘤細胞凋亡等多種基因治療的研究［11］。基因治療的關鍵是選擇安全有效的基因載體，其難點是缺乏靶向性。靶向基因輸送載體具有使基因靶向性地輸送至特定器官或組織、減少組織不良反應、提高基因利用率的優勢。常用的腫瘤靶向基因治療技術主要包括配體靶向、超聲微泡靶向及磁轉染等［12-13］。

高效結合并保護核酸、體積小、可通過細胞膜進入細胞有效表達是基因載體的必要條件。本實驗制備的PEI-SPION-NPs 具備粒徑小、正電位、可結合并保護負電位的質粒DNA 免受核酸酶降解的特性。此外，經過SPION 修飾的PEI-SPION-NPs 具備一定的磁響應性。磁響應性是靶向的前提，也是提高轉染率的關鍵。本研究體外細胞轉染結果表明，PEISPION-NPs 在外加磁場的情況下比PEI 具有更高的轉染效率。轉染示蹤實驗結果顯示，PEI-SPION-NPs主要是通過快速沉積基因載體、提高細胞表面有效載體濃度、增加單位面積細胞內吞載體數量從而推動細胞轉染進程，提高核酸及載體的利用率。

本研究各組細胞存活率和裸鼠體質量變化結果表明，PEI-SPION-NPs的細胞毒性與PEI的細胞毒性存在明顯差異，磁化后PEI-NPs 的細胞毒性降低，可見SPION 的修飾是安全的。研究表明，PEI 的細胞毒性主要是由“質子海綿效應”產生的［14］，帶正電荷的PEI 可增加細胞膜的通透性，破壞線粒體和核膜的完整性，促進線粒體質子釋放，以劑量和時間依賴性的方式抑制電子傳遞鏈［15］。此外，PEI 的細胞毒性可能與其誘導的“細胞自噬”有關［16］。SPION 表面帶負電荷的羧基部分中和了PEI 的正電荷，因此降低了其細胞毒性。PEI-SPION-NPs 良好的細胞相容性初步體現了其在體內的適用價值。

以往的研究顯示，PEI 可攜載基因在動物體內表達，但對其磁靶向輸送方面的研究甚少［17］。本研究體內轉染實驗結果顯示，PEI-SPION-NPs 可攜載基因在裸鼠骨肉瘤組織中成功表達，磁場作用下表達的熒光比較集中，說明外加磁場可抑制基因載體的擴散，促進基因的區域高效表達，降低基因載體的全身反應性。因此，PEI-SPION-NPs 具有粒徑小、低毒性及磁響應性，可實現將基因安全地靶向輸送到細胞和組織的目的，有望成為一種新的基因載體投入應用。下一步我們將對PEI-SPION-NPs 進行表面改性，增加其組織相容性、循環隱蔽性及立體穩定性，探究其在全身循環中的主動靶向應用性能。