不同離心條件所制PRF的生長因子釋放水平及促成纖維細胞增殖、遷移作用比較

賀波，霍繼武，熊竹友，蔣邦紅，陳宇，李光早

1 蚌埠醫學院第一附屬醫院，安徽蚌埠233000；2 組織移植安徽省重點實驗室

富血小板纖維蛋白（PRF）作為新一代血小板制品，因其制作簡單、具有獨特三維纖維網狀結構［1］、能夠攜帶多種促生長因子［2］、不含富血小板血漿（PRP）所需的抗凝劑等優點，被用于多種領域，如創面愈合［3］、口腔種植醫學等［4］。PRF 制備方法多種多樣，基于不同離心條件可制得不同的PRF 制品，如可注射型PRF、富白細胞PRF（L-PRF）、高級PRF（A-PRF）、高級PRF+（A-PRF+）等［5-7］。不同的PRF制品生長因子含量也有所差異。成纖維細胞作為皮膚真皮層的重要組成細胞，在創面愈合的新生肉芽組織形成及膠原蛋白分泌過程中發揮至關重要的作用［8］。2020 年5 月—9 月，本研究觀察了L-PRF、A-PRF、A-PRF+三種制品中血小板衍生生長因子（PDGF-AB）、轉化生長因子β（TGF-β）、血管內皮生長因子（VEGF）釋放水平及各PRF 制品對皮膚成纖維細胞增殖、遷移的作用，深入了解不同PRF 制品對成纖維細胞生長能力影響的差異性。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與主要材料 健康成年雄性SD大鼠30 只，SPF 級，體質量300～400 g，購于濟南朋悅實驗動物繁育有限公司，動物許可證編號為SCXK（魯）2019003。動物實驗流程已通過蚌埠醫學院動物倫理委員會批準（2020 第145 號）。特級胎牛血清（FBS）購自CLARK 公司。DMEM/F12 培養基、PBS緩沖液均購自HyClone 公司。青霉素—鏈霉素雙抗、胰酶細胞消化液、CCK-8 試劑、FITC 標記山羊抗兔熒光二抗均購自Biosharp 公司。Ⅰ型膠原酶購自Yeason 公司。4% 多聚甲醛、DAPI 試劑、5% BSA 封閉液購自Solarbio 公司。波形蛋白（Vimention）一抗購自武漢三鷹生物公司。Transwell 嵌套購自Cron?ing 公司。TritionX-100 購自BioFRoxx 公司。大鼠PDGF-AB、TGF-β、VEGF 的ELISA 試劑盒均購自酶聯生物公司。

1.2 不同PRF 制品制備及條件培養基的獲取 以10% 水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，75% 乙醇消毒左胸部皮膚，采血針于心尖搏動明顯處穿刺采血，用10 mL不含抗凝劑的采血管采集大鼠血液9～10 mL，置于離心機中。分別以708 g 離心12 min、208 g 離心14 min、208 g 離心8 min 制備得到L-PRF、A-PRF、A-PRF+。棄去上層較清亮的貧血小板血漿層及下層的紅細胞層，保留中層膠凍狀的PRF 及少量PRF與紅細胞交界層，置于超凈臺內無菌紗布上。將取出的PRF 制品放于兩層無菌紗布之間，壓平后分別置于24 孔板內，加入等量含10% FBS 及1% 雙抗的DMEM/F12 培養基約2 mL，置于細胞培養箱內孵育。分別于操作后1 h、6 h、1 d、3 d、5 d 收集孔板內條件培養基，-20 ℃保存備用。每次收集后重新加入等量培養基繼續孵育。

1.3 PRF 析出液中生長因子檢測 取出各組條件培養基，待溶解后，置入離心機中，2 000 r/min 離心5 min，分離雜質內容物，收集上清液，采用ELISA 法檢測PDGF-AB、TGF-β、VEGF。

1.4 PRF對成纖維細胞增殖、遷移作用觀察

1.4.1 成纖維細胞的分離培養及鑒定 取健康成年SD 大鼠，背部取皮區剔毛備皮，碘伏及75% 乙醇消毒，取得2 cm×2 cm 的背部皮膚，置于75% 乙醇中浸泡約20 min。將標本放入超凈臺中，于含雙抗的PBS 中浸泡10 min。用無菌刀片剔除表皮層及皮下組織，PBS 緩沖液漂洗干凈后剪成2 mm×2 mm 組織顆粒，放入含0.25% Ⅰ型膠原酶的離心管內消化。將離心管放入37 ℃、CO2培養箱中消化5 h，每隔30 min 搖晃震蕩1 次。待組織基本消化后，經70 μm 細胞濾器過濾去除雜質，置于離心機內2 000 r/min 離心6 min。棄去管內液體，用含10% FBS的DMEM 培養基吹打后分裝入T25培養瓶內，置于培養箱培養，待細胞貼壁后，3 d 換1 次液。待細胞生長至融合度80%～90% 時進行傳代，將P3 細胞以9×103/孔接種于12 孔板的2 孔中，待細胞生長至鋪滿孔徑的90%時，進行Vimentin 免疫熒光實驗鑒定。成纖維細胞在倒置顯微鏡下多數呈長梭形，部分呈扁平星形或三角形分布，細胞突起明顯。細胞抗Vimentin 染色呈綠色，均為陽性表達，細胞核呈橢圓形，被DAPI染液染成藍色，胞質透明不著色。

1.4.2 細胞增殖能力檢測 取P3 代成纖維細胞，以2×103/孔接種于96 孔板中預培養24 h，取不同PRF 條件培養基，使用總體積的20%［9］。將細胞分為L-PRF 組、A-PRF 組、A-PRF+組、空白組，每組設3個復孔，分別以L-PRF、A-PRF、A-PRF+條件培養基和10% FBS 培養基培養。分別于培養后1、3、5 d 加入10 μL 的CCK-8 試劑，孵育2 h 后，酶標儀測定450 nm波長處的光密度（OD）值表示細胞增殖能力。

1.4.3 細胞遷移能力檢測 取P3 代成纖維細胞，消化離心后，PBS 清洗2 次，用不含PBS 的培養基重懸，調整細胞密度，取200 μL 約4×104個細胞的懸液加入上層室，下層室分別加入L-PRF、A-PRF、A-PRF+條件培養基和10% FBS培養基各600 μL，每組設3 個復孔。24 h 后，用鑷子夾出上室，內表面用棉棒輕柔刮擦以去除內側面細胞，PBS清洗2次，稍作風干后，以4%多聚甲醛（上室200 μL、下室500 μL）固定15 min，PBS 清洗2 次。加入500 μL 的0.1% 結晶紫染色液于下室內，染色20 min。PBS 清洗2 次，置于新孔，小室內加100 μL PBS，鏡下觀察拍照。

1.5 統計學方法 采用Graphpad Prism8.0軟件進行統計分析。多組間比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA）。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各PRF 條件培養基中生長因子釋放水平比較 L-PRF 培養基中PDGF-AB 水平于6 h 時達最高值，之后緩慢下降；A-PRF及A-PRF+培養基前3 d呈上升趨勢，后開始下降；A-PRF、A-PRF+培養基制備1 d 后PDGF-AB 釋放水平高于L-PRF，且A-PRF+培養基制備1、3 d時PDGF-AB 釋放水平高于A-PRF（P均＜0.05）。L-PRF 培養基中TGF-β 釋放水平于1 d前均呈上升趨勢，后開始下降，A-PRF、A-PRF+總體呈上升趨勢；制備6 h 后，L-PRF、A-PRF、A-PRF+培養基TGF-β 釋放水平依次增高（P均＜0.05）。各PRF 培養基中的VEGF 于制備后6 h 釋放達最高值，后 明顯 降 低；A-PRF、A-PRF+ 培 養 基 制備1 d 后VEGF 釋放水平高于L-PRF，A-PRF+ 培養基制備6 h、5 d 后VEGF 釋放水平高于A-PRF（P均＜0.05）。制備5 d內A-PRF、A-PRF+培養基PDGF-AB、TGF-β、VEGF 總體釋放水平高于L-PRF 培養基（P均＜0.05）。見表1、表2。

2.2 各組細胞增殖能力比較 見表3。

2.3 各組細胞遷移能力比較 空白組、L-PRF 組、A-PRF 組、A-PRF+組培養24 h 后穿膜細胞數分別為（24.01 ± 2.41）、（40.81 ± 2.61）、（66.91 ± 2.21）、（74.51 ± 3.55）個。L-PRF 組、A-PRF 組、A-PRF+組穿膜細胞數高于空白組，且A-PRF 組、A-PRF+組穿膜細胞數高于L-PRF組（P均＜0.05）。

表1 各PRF條件培養基制備不同時點PDGF-AB、TGF-β、VEGF釋放水平比較（）

表1 各PRF條件培養基制備不同時點PDGF-AB、TGF-β、VEGF釋放水平比較（）

注：與L-PRF相比，*P＜0.05；與A-PRF相比，△P＜0.05。

培養基L-PRF 1 h 6 h 1 d 3 d 5 d A-PRF 1 h 6 h 1 d 3 d 5 d A-PRF+1 h 6 h 1 d 3 d 5 d PDGF-AB（pg/mL）TGF-β（ng/mL）VEGF（pg/mL）1 869.27 ± 96.76 2 178.51 ± 113.66 1 862.39 ± 96.87 1 566.26 ± 22.01 899.29 ± 16.15 2.71 ± 0.15 4.56 ± 0.17 6.84 ± 0.39 3.33 ± 1.35 2.75 ± 0.17 54.35 ± 2.25 72.56 ± 2.24 36.41 ± 2.00 31.13 ± 2.04 22.84 ± 2.65 1 752.43 ± 76.81 1 997.03 ± 53.75 2 176.64 ± 42.22*2 541.30 ± 97.45*2 153.16 ± 118.68*2.98 ± 0.58 5.83 ± 0.09*9.75 ± 0.44*11.77 ± 1.28*6.40 ± 0.84*69.89 ± 2.95*80.92 ± 1.66*43.29 ± 1.08*40.33 ± 1.75*23.39 ± 1.81 69.19 ± 0.64*88.96 ± 1.83*△43.13 ± 2.37*41.91 ± 2.21*33.66 ± 1.99*△1 799.55 ± 44.77 2 053.15 ± 67.65 2 769.87 ± 46.07*△3 247.44 ± 103.63*△2 397.93 ± 115.51*3.58 ± 0.13 6.81 ± 0.32*△12.40 ± 1.04*△16.10 ± 0.69*△11.64 ± 0.91*△

表2 各PRF條件培養基制備5 d內PDGF-AB、TGF-β、VEGF總釋放水平比較（）

表2 各PRF條件培養基制備5 d內PDGF-AB、TGF-β、VEGF總釋放水平比較（）

注：與L-PRF相比，*P＜0.05；與A-PRF相比，△P＜0.05。

培養基L-PRF A-PRF A-PRF+VEGF（pg/mL）217.28 ± 4.02 257.81 ± 6.12*276.85 ± 6.20*△PDGF-AB（pg/mL）8 375.68 ± 273.96 1 062.55 ± 306.31*12 267.95 ± 239.01*△TGF-β（ng/mL）20.19 ± 1.56 36.73 ± 1.94*50.53 ± 1.38*△

表3 各組培養不同時間細胞增殖能力比較（）

表3 各組培養不同時間細胞增殖能力比較（）

注：與空白組相比，*P＜0.05；與L-PRF組相比，△P＜0.05。

組別A-PRF+組A-PRF組L-PRF組空白組細胞增殖能力5 d 1.76 ± 0.09*1.72 ± 0.03*1.59 ± 0.07*0.98 ± 0.12 1 d 0.38 ± 0.03 0.28 ± 0.02 0.29 ± 0.04 0.35 ± 0.04 3 d 1.41 ± 0.10*△1.31 ± 0.06*△1.10 ± 0.02*0.62 ± 0.01

3 討論

隨著整復學科的迅速發展，自體血液提取物開始推廣應用。PRF 作為第二代血富血小板制品，相較于PRP，其無需使用如抗凝劑等的添加劑，三維空間網狀結構可容納更多生長因子，制備簡單，并且還提供了三維纖維蛋白基質，可用作多種程序的支架，在引導性骨再生和引導性組織再生程序中發揮屏障膜功能［10］。鑒于這些優點，PRF 已被廣泛應用于創面修復、齒槽裂骨修復等領域［11-12］。

PRF 富含多種生長因子，血小板內的α 顆粒被激活后，會緩慢釋放多種生長因子，包括PDGF-AB、TGF-β、VEGF，PDGF 和TGF-β 可刺激成纖維細胞遷移并上調整聯蛋白受體的表達，而VEGF 在創面愈合過程中可刺激新生血管生長［13］。這些因子之間相互平衡制約，在組織愈合過程中都發揮著重要的作用［14］。近年研究報道，低速離心條件制備的A-PRF、A-PRF+更有利于纖維蛋白內多種生長因子的釋放。研究發現，L-PRF、PRP、A-PRF+三者比較，以A-PRF+的生長因子釋放量更高［15］。也有學者報道，減少相對離心力則PRF生長因子釋放能力更強［16］。GHANAA?TI等［7］認為，過高的離心速度會導致白細胞和其他生長因子損失，利用較低的離心速度有助于提高白細胞和生長因子的數量。然而DOHAN EHRENFEST等［17］的研究表明，較高離心力制備出的L-PRF的結構更加穩定，所釋放的生長因子含量更高。上述實驗結果的差異可能與PRF制作工藝的選擇有關。

本研究利用不同相對離心力及離心時間分別制備得到L-PRF、A-PRF、A-PRF+，并將其置于不同的培養基中獲得PRF 條件培養基，利用ELISA 法測定各時間段的培養基生長因子釋放情況及累計釋放總量，結果顯示，制備5 d 內A-PRF、A-PRF+培養基PDGF-AB、TGF-β、VEGF 總體釋放水平高于L-PRF培養基，提示A-PRF、A-PRF+培養基的PDGF-AB、TGF-β、VEGF 釋放能力強于L-PRF 培養基，且以APRF+培養基作用最強。進一步利用富含PRF 滲出液的培養基培養成纖維細胞，觀察其增殖、遷移能力的變化。A-PRF+組、A-PRF 組、L-PRF 組培養3、5 d時細胞增殖能力均高于空白組，且培養3 d 時A-PRF+組、A-PRF 組細胞增殖能力高于L-PRF 組；L-PRF 組、A-PRF 組、A-PRF+組穿膜細胞數高于空白組，且A-PRF 組、A-PRF+ 組穿膜細胞數高于L-PRF 組。這提示在組織修復的過程中，較低的離心力制備得到的PRF 能夠更加有效地促進成纖維細胞于創口處大量募集與增殖，促進創面愈合。

結合上述研究結果，我們認為，通過降低相對離心力制備得到的A-PRF+和A-PRF的生長因子釋放性能、促進成纖維細胞增殖和遷移的作用明顯強于L-PRF，且適當縮短離心時間得到的A-PRF+作用更強。