SBF2-AS1 在食管鱗癌中的表達變化及其對腫瘤細胞KYSE410增殖、放療敏感性的影響

李曉敏，查文娟，鐵小偉，李皓，高飛，劉陽晨

蚌埠醫學院附屬泰興市人民醫院，江蘇泰州225400

食管癌是常見的惡性腫瘤之一［1］。我國食管癌病理類型主要為鱗狀細胞癌［2］。因食管癌早期癥狀缺乏特異性，且易發生侵襲及轉移，大多數患者確診已為晚期，失去手術機會，5 年生存率＜30%。放療是中晚期食管癌的主要治療手段［3］。然而，晚期食管癌患者放療后局部控制不理想或復發者占50%～60%［4］。放療抵抗是影響腫瘤治療效果和患者預后的重要因素。因此，尋找食管癌放療敏感性相關分子標志物，有望提高放療敏感性。研究證實，長鏈非編碼RNA（lncRNA）與多種惡性腫瘤（如非小細胞肺癌、食管鱗癌、胃癌、鼻咽癌等）的增殖、遷移、侵襲、轉移、化療耐藥、放療敏感性等有關［5-9］。SBF2-AS1是一種新發現的lncRNA，位于染色體11p15.1，是SBF2的一個2 708 nt的反義RNA［10］。研究發現其在多種腫瘤中高表達，參與調控腫瘤的發生發展［11-12］。2019 年10 月—2020 年6 月，本研究觀察了SBF2-AS1在食管鱗癌中的表達變化及其對食管鱗癌細胞KYSE410 增殖、放療敏感性的影響，探討可能的作用機制。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 組織、細胞及主要實驗材料 食管鱗癌切除手術中留取的食管鱗癌組織及其配對的癌旁（距腫瘤組織邊緣＞5 cm）正常組織87例。患者男56 例、女21例，年齡18～70（61.33 ± 7.06）歲，腫瘤直徑≤5 cm 56 例、＞5 cm 31 例，TNM 分期T1～T2期35 例、T3～T4期52 例，淋巴結轉移為N0～N156 例，N2～N331 例，分化程度為低分化45 例、中高分化42 例。患者為初診，術前未接受任何抗腫瘤治療，經術后組織病理檢查證實診斷，臨床病理資料和隨訪資料完整。排除合并其他部位惡性腫瘤者，合并嚴重肝、腎等重要臟器功能不全者。食管鱗癌細胞KYSE410、食管正常上皮細胞HEEPIC 由蚌埠醫學院附屬泰興市人民醫院實驗室凍存。RPMI1640、胎牛血清購自美國Gibco公司。 TRIzol、PrimeScriptTMRT Master Mix（Perfect Real Time）逆轉錄試劑盒、SYBR Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒購自日本TaKaRa 公司。siRNA-SBF2-AS1 及引物購自上海生物工程有限公司。Lipofectamine RNA iMAX Reagent 購自美國Invitrogen 公司。CCK-8、EdU、0.1% 結晶紫、胰蛋白酶、Western blotting 試劑盒購自上海碧云天生物科技有限公司。Annexin V-FITC 凋亡檢測試劑盒購自BD Biosciences 公司。本研究經醫院醫學倫理委員會批準，患者或其家屬知情同意。

1.2 食管鱗癌組織、細胞中SBF2-AS1 檢測 采用TRIzol 試劑提取食管鱗癌組織、癌旁正常組織及KYSE410 細 胞 和HEEPIC 細 胞 的 總RNA。 按 照PrimeScriptTMRT Master Mix（Perfect Real Time）逆轉錄試劑盒說明書將RNA 逆轉錄為cDNA。 采用SYBR Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒進行熒光定量PCR擴增，以GAPDH 作為內參照。SBF2-AS1 上游引物序列為5′-CACGACCCAGAAAGAvGTCTAC-3′，下游引 物 序 列 為5′-CCCGGTACCTTCCTGTCATA-3′；GAPDH 上游引物序列為5′-CTGGGCTACACTGAG?CACC-3′，下 游 引 物 序 列 為5′-AAGTGGTCGTT?GAGGGCAATG-3′。以2－ΔΔCt計算目的基因相對表達量。實驗重復3次，取平均值。

1.3 下調SBF2-AS1表達對食管鱗癌細胞增殖能力的影響觀察

1.3.1 細胞分組 KYSE410 細胞用含10% 胎牛血清和1% 雙抗的RPMI1640 培養液于37 ℃、5% CO2培養箱中培養，取處于對數生長期的細胞，分為siR?NA-SBF2-AS1 組、NC 組。 使 用Lipofectamine RNA iMAX Reagent分別將siRNA-SBF2-AS1、NC轉染siR?NA-SBF2-AS1 組、NC 組細胞。qRT-PCR 檢測siR?NA-SBF2-AS1組細胞中SBF2-AS1表達較NC組顯著下降（分別為0.33 ± 0.02、1.00 ± 0.00）。

1.3.2 細胞增殖能力檢測 采用CCK-8實驗。將siRNA-SBF2-AS1組、NC組的細胞按2×103/孔接種于96 孔板中，分別于0、24、48、72、96 h 后每孔加入CCK-8溶液10 μL，37 ℃孵育2 h，酶標儀于450 nm波長處測定光密度（OD）值。每組設置3個復孔，取平均值。

1.4 下調SBF2-AS1表達對食管鱗癌細胞放療敏感性的影響觀察

1.4.1 細胞分組及放療方法 分組及操作參照“1.3.1”。將siRNA-SBF2-AS1 組、NC 組處于對數生長期的細胞以5×104/孔接種于6 孔板中，貼壁后用4 Gy的X射線照射，6 mV射線，劑量率為300 mU/min，機架角為180°，SSD源皮距100 cm，繼續培養48 h。

1.4.2 細胞增殖能力觀察 采用EdU 實驗。用細胞培養液1∶500稀釋EdU，37 ℃預熱5 min；放療處理細胞后，將6孔板中細胞培養液留至1 mL，每孔加入稀釋預熱后的EdU，細胞培養箱中孵育2 h，棄去培養液；按照EdU 試劑盒說明書每孔加入固定液、通透液、洗滌液，棄去洗滌液；每孔加入用PBS 1∶1 000稀釋的Hoechst33342反應液，室溫避光孵育10 min，棄去反應液，洗滌液洗滌3 次、每次3～5 min；熒光顯微鏡下觀察，有綠色熒光為增殖細胞。

1.4.3 細胞凋亡率測算 采用流式細胞術。將經放療處理后的細胞用預冷的PBS 漂洗1 次，胰酶消化細胞，離心后去上清，PBS 漂洗2 次，收集1×106個細胞，重懸細胞于100 μL 結合緩沖液中，加入An?nexinV-FITC 5 μL 混勻后加入PI 5 μL 混勻，室溫避光孵育20 min，加入結合緩沖液400 μL 濾過濾網，流氏細胞儀測算兩組細胞凋亡率。

1.4.4 放療敏感性評價 采用克隆形成實驗。取siRNA-SBF2-AS1組、NC組細胞分別以2×102、5×102、1×103、2×103、5×103/孔接種于96 孔板中，給予0、2、4、6、8 Gy 的射線照射，照射條件同“1.4.1”，每組設置3 個復孔；繼續培養細胞10～14 d，待形成肉眼可見的菌落時，棄去培養基，PBS 漂洗2 遍，用90% 乙醇固定細胞15 min，棄去乙醇，PBS 漂洗2 遍，用0.1% 結晶紫染色20 min，顯微鏡下計數單克隆數（≥50 個細胞計為1 個單克隆）。計算兩組細胞存活分數（SF）和細胞克隆形成率（PE）。SF=（受照射組PE/對照組細胞PE）×100%。PE=（克隆細胞數/接種細胞數）×100%。繪制單擊多靶模型擬合細胞存活曲線。根據細胞存活曲線得出D0（終斜率的倒數）、Dq（準閾劑量）、SF2（離體腫瘤培養細胞經2 Gy照射后的SF），并計算放射增敏比。放射增敏比=si-NC組D0/siRNA-SBF2-AS1組D0。

1.4.5 細胞中E2F 轉錄因子1（E2F1）蛋白檢測采用Western blotting 法。用含有PMSF 的PIPA 裂解液提取siRNA-SBF2-AS1組、NC 組細胞總蛋白，冰上孵育30 min，4 ℃、12 000 g 離心15 min，取上清液。用BCA 蛋白分析試劑盒進行蛋白定量。將蛋白樣品與5×loading buffer混勻，金屬浴100 ℃煮沸5 min。用10% SDS-PAGE 凝膠電泳分離蛋白質，然后轉移至聚氟乙烯（PVDF）膜上，封閉2 h，洗滌液洗膜3次。加入稀釋的抗E2F1 抗體（1∶1 000）4 ℃孵育過夜，然后用稀釋的辣根過氧化物標記的二抗室溫下孵育2 h。取ECL熒光檢測試劑盒，在暗室中加入適量A 液、B 液的混合液，滴于膜上，凝膠成像系統掃描成像，分析各組E2F1蛋白相對表達水平。

1.5 統計學方法 采用SPSS23.0 統計軟件。計量資料以表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗。計數資料采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 食管鱗癌SBF2-AS1表達變化及與腫瘤臨床病理參數的關系 食管鱗癌組織、癌旁正常組織中SBF2-AS1 相對表達量分別為1.94 ± 1.24、0.95 ±0.64，KYSE410 細胞、HEEPIC 細胞中SBF2-AS1 相對表達量分別為5.18 ± 0.07、1.00 ± 0.00，食管鱗癌組織和細胞中SBF2-AS1 表達高于癌旁正常組織和正常食管上皮細胞（P均＜0.05）。腫瘤直徑＞5 cm者、T3～T4期者SBF2-AS1 相對表達量分別高于直徑≤5 cm者、T1～T2期者（P均＜0.05）。見表1。

表1 不同臨床病理參數的食管鱗癌組織中SBF2-AS1表達比較（）

表1 不同臨床病理參數的食管鱗癌組織中SBF2-AS1表達比較（）

注：與腫瘤直徑＞5 cm者相比，*P＜0.05；與T3～T4期者相比，#P＜0.05。

臨床病理參數性別n SBF2-AS1男女66 21 2.14 ± 1.12 2.44 ± 1.30年齡（歲）≤60＞60腫瘤直徑≤5 cm＞5 cm TNM分期T1～T2 T3～T4淋巴結轉移N0～N1 N2～N3分化程度低分化高分化52 35 2.08 ± 1.07 2.41 ± 1.28 31 56 2.05 ± 1.39*2.31 ± 1.02 35 52 1.73 ± 1.10#2.54 ± 1.10 56 31 2.18 ± 1.19 2.18 ± 1.13 2.29 ± 1.26 2.14 ± 1.06 45 42

2.2 下調SBF2-AS1 表達對食管鱗癌細胞增殖能力的影響 轉染24、48、72、96 h 后siRNA-SBF2-AS1 組細胞增殖能力低于NC 組（P均＜0.05）。見表2。

表2 轉染不同時點siRNA-SBF2-AS1組、NC組細胞增殖能力比較（）

表2 轉染不同時點siRNA-SBF2-AS1組、NC組細胞增殖能力比較（）

注：與同時點NC組相比，*P＜0.05。

組別siRNA-SBF2-AS1組NC組細胞增殖能力96 h 1.52 ± 0.09*2.27 ± 0.05 0 h 0.21 ± 0.00*0.21 ± 0.00 24 h 0.51 ± 0.09*1.04 ± 0.06 48 h 1.00 ± 0.09*1.63 ± 0.07 72 h 1.36 ± 0.06*1.96 ± 0.05

2.3 下調SBF2-AS1表達對食管鱗癌細胞放療敏感性的影響 不同X 線照射條件的siRNA-SBF2-AS1組細胞增殖率、E2F1蛋白表達均低于NC 組，細胞凋亡率高于NC 組；照射后細胞增殖率和E2F1 蛋白表達低于未照射細胞，細胞凋亡率高于未照射細胞（P均＜0.05）。詳見表3。siRNA-SBF2-AS1 組細胞D0、Dq、SF2低于NC 組（P均＜0.05），單擊多靶模型參數值計算其放射增敏比為2.00 ± 0.10。見表4。

表3 siRNA-SBF2-AS1組、NC組不同X線照射條件下細胞增殖率、凋亡率及E2F1蛋白表達比較（）

表3 siRNA-SBF2-AS1組、NC組不同X線照射條件下細胞增殖率、凋亡率及E2F1蛋白表達比較（）

注：與相同條件NC 組相比，*P＜0.05；與同組未照射細胞相比，#P＜0.05。

組別細胞增殖率（%）細胞凋亡率（%）E2F1蛋白表達siRNA-SBF2-AS1組照射未照射NC組照射未照射26.67 ± 0.56*#35.13 ± 1.09*15.88 ± 0.61*#11.79 ± 0.31*0.37 ± 0.02*#0.57± 0.00*0.59 ± 0.00#0.91 ± 0.01 42.35 ± 0.80#52.72 ± 0.54 8.74 ± 0.34#6.59 ± 0.53

表4 siRNA-SBF2-AS1組、NC組單擊多靶模型擬合細胞存活曲線參數比較（）

表4 siRNA-SBF2-AS1組、NC組單擊多靶模型擬合細胞存活曲線參數比較（）

注：與NC組相比，*P＜0.05。

組別siRNA-SBF2-AS1組NC組SF2 0.59 ± 0.09*0.72 ± 0.18 D0 Dq 0.58 ± 0.02*1.17 ± 0.10 1.24 ± 0.05*2.55 ± 0.12

3 討論

盡管近年來食管癌的診斷和治療方法已有所改進，但晚期食管癌患者的生存率仍然很低［13］。食管癌的診治是目前研究的難點和熱點。探索食管癌發生發展的相關基因及可能的機制有助于為食管癌的診治提供新的方向。

lncRNA 表達失調在腫瘤的發生發展過程中發揮重要作用。SBF2-AS1 已被證實在多種腫瘤中發揮促癌作用，參與腫瘤的發生發展，其機制可能是作為“ceRNA”靶向調控下游靶點，從而調控細胞的增殖、侵襲、轉移等生物學過程。如SBF2-AS1 可通過競爭性抑制miR-30a 來靶向調節叉頭框蛋白家族成員A1表達，促進骨肉瘤的增殖、侵襲和遷移，發揮促癌作用［14］。SBF2-AS1 可競爭性集合miR-140-5p 靶向調節轉化生長因子β 受體1 從而促進肝癌細胞的增殖和侵襲［15］。研究證實，SBF2-AS1在食管鱗癌細胞ECA109 中高表達；沉默SBF2-AS1 后，細胞的增殖能力、集落形成能力、侵襲和遷移能力均顯著受到抑制［16］。本研究發現，SBF2-AS1在食管癌組織和細胞中顯著高表達，且其表達水平與腫瘤大小、TNM分期有關，與患者性別、年齡、淋巴結轉移情況、腫瘤分化程度無關；下調SBF2-AS1 表達后，KYSE410 細胞的增殖能力顯著受到抑制，表明SBF2-AS1在食管癌中發揮促癌作用。

放療是上段食管癌及中晚期食管癌的主要治療手段。隨著放療技術的不斷發展，食管癌放療療效不斷提高，但由于腫瘤遺傳特性改變、惡性腫瘤組織對放療的敏感性差異及周圍正常組織對放射劑量耐受性限制等因素，影響放療效果，導致腫瘤局部復發或轉移［17］。因此，探索影響腫瘤細胞放射抵抗的分子機制，改善腫瘤的放療敏感性，可為改善食管癌的治療效果及預后提供幫助。

大量研究證實，lncRNA 可調控食管癌放療敏感性。沉默Rpph1 可增加食管癌細胞的放療敏感性［18］。結腸癌相關轉錄本2 可誘導食管癌細胞的放療抵抗［19］。最近有研究表明，SBF2-AS1可誘導非小細胞肺癌的放療耐受，下調SBF2-AS1 可通過抑制miR-302a/MBNL3 axis 軸增強非小細胞肺癌細胞的放療敏感性［20］，但在其他腫瘤中未見報道。本研究結果顯示，下調SBF2-AS1 表達后，KYSE410 細胞的增殖能力下降，給予X 線照射后的細胞增殖率和存活分數下降、凋亡率和放射增敏比增高，提示下調SBF2-AS1表達可增加食管癌細胞的放療敏感性，與SBF2-AS1在其他惡性腫瘤中的相關研究結果一致。

E2F1 是E2F 轉錄因子家族的成員，其可通過調控多種lncRNA 參與細胞增殖、侵襲、轉移等多項生物學過程［21-23］。有研究證實，在宮頸癌中下調E2F1的表達，細胞存活率降低，細胞凋亡率增加，其高表達與放療敏感性降低及預后不良有關［24］。還有學者發現，在非小細胞肺癌中E2F1 可誘導SBF2-AS1 表達上調，促進細胞的增殖、侵襲和轉移［25］。本研究結果顯示，對SBF2-AS1表達下調的食管鱗癌細胞進行X 線照射后，細胞增殖抑制，細胞凋亡增多，E2F1 蛋白表達水平降低。

綜上所述，SBF2-AS1 在食管癌組織和細胞中高表達；下調SBF2-AS1 表達可抑制食管鱗癌細胞增殖，提高放療敏感性，其機制可能與調控E2F1 蛋白表達有關，具體作用機制有待進一步研究。