響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波提取杏鮑菇三萜化合物的工藝研究

林繼輝，賴俊杰，劉蒙佳

(福建師范大學(xué) 閩南科技學(xué)院，福建 南安 263223)

杏鮑菇含有較高的蛋白質(zhì)和較低的脂肪以及人體所需的各種不同的氨基酸[1-3]，同時(shí)它也是一種含有較多三萜類化合物的菌類.而且在食用菌中三萜化合物里所含的三萜烯和三萜皂苷含量比較豐富.三萜化合物主要存在形式是游離形式或者與糖結(jié)合成苷或成酯.經(jīng)過大量實(shí)驗(yàn)得出三萜化合物具有以下這些作用：可以降低人體中的血脂含量、降低膽固醇的含量、抗腫瘤、潤(rùn)腸道、增強(qiáng)免疫力、美容以及防止心血管病等藥效[4].但很少有關(guān)于優(yōu)質(zhì)品種的選育、高產(chǎn)量栽培以及商品化杏鮑菇中三萜化合物的提取工藝研究及其優(yōu)化的報(bào)道[5-7].

目前國(guó)內(nèi)外三萜化合物的提取方法有：堿水提取法，其缺點(diǎn)是提取效率低；索氏提取法，其缺點(diǎn)是僅限于實(shí)驗(yàn)室研究，不適合規(guī)模化；有機(jī)溶劑提取法，其缺點(diǎn)是受熱時(shí)間長(zhǎng)比較不穩(wěn)定，但是它的優(yōu)點(diǎn)也很多，所需的提取周期短、提取溫度低、溶出率高、適應(yīng)性廣、操作比較容易等[8-9].本實(shí)驗(yàn)采用的是以乙醇溶液為提取劑的有機(jī)溶劑提取法，再利用響應(yīng)面分析法[10]確定杏鮑菇中三萜化合物的最佳提取工藝條件.由于該方法操作簡(jiǎn)單，耗費(fèi)的時(shí)間也較少，能夠?yàn)樯疃乳_發(fā)和規(guī)模化提取杏鮑菇三萜化合物提供技術(shù)支持和理論基礎(chǔ).

1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.1 主要儀器與試劑

JP-150A型高速多功能粉碎機(jī)，永康市久品工貿(mào)有限公司；KQ5200B型超聲波清洗機(jī)，昆山市超聲儀器有限公司；721-VIS型紫外可見分光光度計(jì)，上海佑科儀器儀表廠；

純度為99%香草醛、98%齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品；無水乙醇、冰醋酸、高氯酸等均為分析純.

1.2 材料與實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 材料準(zhǔn)備

準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)所需要的新鮮杏鮑菇，將其清洗干凈，用水果刀將其切成薄片后，放在 50 ℃ 烘箱里恒溫烘干.再將烘干后的杏鮑菇放進(jìn)粉碎機(jī)里粉碎至粉末，最后用規(guī)格為 0.301 mm 的篩網(wǎng)篩選，將過篩后的這些粉末裝進(jìn)規(guī)格為 250 mL 的光口試劑瓶中進(jìn)行密封保存，以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)所用[9].

1.2.2 三萜化合物的提取

準(zhǔn)確稱取 2.0 g 的杏鮑菇粉末于錐形瓶中，按照一定的料液比加入乙醇水溶液，攪拌至均勻.再將其放在超聲設(shè)備中，在一定溫度下超聲處理，取出后抽濾. 5 000 r/min 離心 5 min ,取上清液.

1.2.3 齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確稱取齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品 5.0 mg 于燒杯中，倒入適量的無水乙醇溶液使其充分溶解后移入規(guī)格為 50 mL 容量瓶中，再用無水乙醇定容至刻度線.依次用移液管量取標(biāo)準(zhǔn)溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mL 于8支比色管中，另取1支加入 1 mL 無水乙醇的空白對(duì)照比色管，然后將9支管置于熱水中揮去溶劑后，用移液管移取 0.4 mL 新制的5%冰醋酸-香草醛和 1 mL 的高氯酸于上述9支管內(nèi)，快速震蕩混勻.再將其放入提前設(shè)定好的溫度為 60 ℃ 的恒溫水浴鍋中，計(jì)時(shí)加熱 15 min.最后，利用夾子將其逐個(gè)取出后，冷卻至室溫.再往其內(nèi)加冰醋酸定容至 5 mL 刻度線處，迅速混勻溶液.取適量的溶液小心倒入比色皿中，然后利用紫外分光光度計(jì)在波長(zhǎng) 545 nm 處測(cè)定吸光值.利用origin制圖軟件繪制出以橫坐標(biāo)為齊墩果酸的質(zhì)量濃度(μg/mL)和縱坐標(biāo)為吸光值(A)的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖[11].

1.2.4 三萜化合物的測(cè)定

采用5%香草醛-冰醋酸溶液顯色比色法[12]測(cè)定三萜化合物.其原理是因?yàn)槿苹衔镏械牧u基在高氯酸的作用下脫水與香草醛結(jié)構(gòu)中的醛基發(fā)生縮合反應(yīng)產(chǎn)生雙鍵結(jié)構(gòu)，并在冰醋酸的作用下生成碳正離子鹽紫色物質(zhì).用移液管準(zhǔn)確移取 0.2 mL 上清液、0.4 mL 新制的5%冰醋酸-香草醛，再小心移取 1.0 mL 高氯酸(避免灼傷)于燒杯中，并將其快速震蕩混勻.將混合液置于 60 ℃ 的恒溫水浴中，加熱 15 min.最后，利用夾子將燒杯取出后，放在裝有冷水的水箱中，將溶液冷卻至 25 ℃.加入冰醋酸定容至刻度線為 5 mL 處，迅速混勻溶液.取適量的溶液小心倒入比色皿中避免手被灼傷，然后在波長(zhǎng) 545 nm 處，利用紫外可見分光光度計(jì)測(cè)定其吸光度[13],后代入齊墩果酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程中計(jì)算得出三萜化合物的質(zhì)量濃度ρ.并按照式子(1)進(jìn)行計(jì)算提取率(Y).

(1)

其中，V為提取液體積(mL)；ρ為齊墩果酸的質(zhì)量濃度(μg/mL)；M為樣品的質(zhì)量(g).

1.2.5 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1) 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)三萜化合物提取得率的影響 準(zhǔn)確稱取 2.0 g 的杏鮑菇粉末5份倒入5個(gè)規(guī)格為 250 mL 的錐形瓶中，按料液比為1∶25(g/mL)加入乙醇溶液然后放入溫度為 55 ℃ 的超聲波清洗機(jī)中進(jìn)行超聲 30 min，考察體積分?jǐn)?shù)為65%、70%、75%、80%、85%的乙醇溶液，對(duì)三萜化合物提取率的影響，以確定最佳乙醇濃度.

2) 超聲時(shí)間對(duì)三萜化合物提取率的影響 準(zhǔn)確稱取 2.0 g 的杏鮑菇粉末5份倒入5個(gè)規(guī)格為 250 mL 的錐形瓶中，按料液比為1∶25(g/mL)加入75%乙醇溶液然后放入溫度為 55 ℃ 的超聲波清洗機(jī)中進(jìn)行超聲，考察提取時(shí)間分別為：15、20、25、30、35 min 對(duì)三萜化合物提取率的影響，以確定最佳超聲提取時(shí)間.

3) 提取溫度對(duì)三萜化合物提取率的影響 準(zhǔn)確稱取 2.0 g 的杏鮑菇粉末5份倒入5個(gè)規(guī)格為 250 mL 的錐形瓶中，按料液比為1∶25(g/mL)加入75%乙醇溶液然后放入超聲波清洗機(jī)中超聲 25 min，考察提取溫度為：25、35、45、55、65 ℃ 對(duì)三萜化合物提取率的影響，以確定最佳超聲提取溫度.

4) 料液比對(duì)三萜化合物提取率的影響 準(zhǔn)確稱取 2.0 g 的杏鮑菇粉末5份倒入5個(gè)規(guī)格為 250 mL 的錐形瓶中，加入75%乙醇溶液，在提取溫度為 55 ℃ 超聲波清洗機(jī)中超聲 25 min，考察料液比分別為： 1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25(g/mL)，對(duì)三萜化合物提取率的影響，以確定最佳料液比.

1.2.6 響應(yīng)面設(shè)計(jì)

采用Box-Behnken中心組合原理，對(duì)以上單因素進(jìn)行四因素三水平的試驗(yàn)設(shè)計(jì)[14-16].編碼情況如表1所示.

表1 響應(yīng)面設(shè)計(jì)編碼表

1.2.7 數(shù)據(jù)處理

采用origin8.0軟件進(jìn)行繪圖，采用Design-Expert8.0.5b響應(yīng)面軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)方差分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

按照步驟2.2.3齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作方法，將不同溶度所對(duì)應(yīng)的吸光度輸出繪圖軟件得出吸光值(y)與齊墩果酸質(zhì)量濃度(x)的線性回歸方程為：y=0.043 7x-0.005 4，R2=0.997 5.

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)三萜化合物提取得率的影響

由圖1可知，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的逐漸升高三萜化合物提取得率呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì).當(dāng)乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)在65%～75%的時(shí)候，三萜化合物提取得率隨乙醇體積分?jǐn)?shù)濃度升高而增大，其原因是齊墩果酸三萜化合物是屬于不溶于水的物質(zhì)，但是在于醇、乙酸乙酯和丙酮等有機(jī)溶液中卻極易溶解[17-18].所以只要在適當(dāng)?shù)囊掖俭w積分?jǐn)?shù)條件下是可以增加其提取率的.但是當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)在75%～85%時(shí)，三萜化合物提取率卻因乙醇體積分?jǐn)?shù)的逐漸升高而顯現(xiàn)出慢慢降低的趨勢(shì)，原因是當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到一定百分比時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)會(huì)發(fā)生變性凝固的現(xiàn)象，從而形成一定的傳質(zhì)阻力為提取增加難度，導(dǎo)致三萜化合物提取率下降，所以綜合考慮最佳提取的乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)為75%.

圖1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)三萜化合物提取率的影響

2.2.2 超聲時(shí)間對(duì)三萜化合物提取率的影響

由圖2可知，當(dāng)超聲時(shí)間在15～25min的時(shí)候，三萜化合物的提取率呈現(xiàn)連續(xù)升高趨勢(shì)，這是由于隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，物料與溶劑的混合程度會(huì)越來越充分，同時(shí)在超聲波的協(xié)助下有利于細(xì)胞內(nèi)部的三萜化合物的溶出，所以提取率逐漸升高.當(dāng)超聲時(shí)間在25～35 min 時(shí)，隨著超聲時(shí)間的增加提取率卻越來越低，原因來自兩方面，其一是因?yàn)槌晻r(shí)間的延長(zhǎng)會(huì)使物料中含有其他溶于醇的成分慢慢溶出，從而會(huì)與三萜化合物形成溶劑競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，與此同時(shí)可能也增加了其他雜質(zhì)，不利于提取[17]；其二是隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，帶來強(qiáng)的機(jī)械振動(dòng)可能會(huì)破壞溶出的三萜化合物，進(jìn)而使提取率下降.所以，三萜化合物的提取時(shí)間選取在 25 min 時(shí)為宜.

圖2 超聲時(shí)間對(duì)三萜化合物提取率的影響

2.2.3 提取溫度對(duì)三萜化合物提取率的影響

由圖3可知，當(dāng)提取溫度在25～45 ℃ 之間時(shí)，三萜化合物提取率的增長(zhǎng)速度為先慢后快，這是因?yàn)闇囟鹊闹饾u升高會(huì)增加物料中三萜化合物的溶出，從而有利于提取.但在提取溫度為45～65 ℃ 時(shí)，溫度的不斷升高使三萜化合物提取率下降，是因?yàn)闇囟鹊纳呒涌炝巳軇┑膿]發(fā)速度，再加上其它物質(zhì)的溶出從而影響后續(xù)的提取.所以，確定最佳提取溫度為 45 ℃.

圖3 提取溫度對(duì)三萜化合物提取率的影響

2.2.4 料液比對(duì)三萜化合物提取率的影響

由圖4可知，當(dāng)物料與乙醇溶液比例(g/mL)在1∶5～1∶20之間時(shí)，隨著料液比比值的升高三萜化合物提取率也隨之上升，這是因?yàn)殡S著乙醇溶液的增加使物料與溶劑接觸碰撞的概率增加，有利于三萜化合物的溶出，使得提取率隨料液比的增加而上升；后面出現(xiàn)提取率下降，這主要是由于物料中的提取物含量有限，即使溶劑繼續(xù)增加時(shí)對(duì)提取率的影響不大，反而使其他物質(zhì)溶出而降低其提取率.所以確定提取的最佳料液比為1∶20(g/mL).

圖4 料液比對(duì)三萜化合物提取率的影響

2.3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析

2.3.1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果

利用超聲波提取杏鮑菇中三萜化合物，對(duì)單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果通過Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化三萜化合物提取工藝參數(shù)，響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2.

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果

續(xù)表

標(biāo)號(hào)因素ABCD得率/(μg·g-1)22000027925100-125026-1010243270110271280-1-10165291001261

2.3.2 模型的建立及顯著性分析

利用Design-Expert 8.0.5b軟件，對(duì)上表中的數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合處理，得出提取率Y=287.80+5.08×A+46.83×B-9.58×C-0.67×D+1.00×AB+0.50×AC+0.75×AD+1.0×BC-2.0×BD-15.75×CD-15.36×A2-50.23×B2-24.11×C2-25.73×D2的回歸方程.

對(duì)該方程的有效性進(jìn)行檢測(cè)，利用響應(yīng)面軟件對(duì)模型的方差進(jìn)行分析.

由表3方差分析表可知，該實(shí)驗(yàn)中方差來源：A2的(P<0.05)表示影響顯著，B，B2，C2，D2的(P<0.01)表示影響極顯著.再通過F值的大小比較，從而可以得出各因素對(duì)三萜化合物的主次關(guān)系為：B(料液比)>C(超聲時(shí)間)>A(乙醇體積分?jǐn)?shù))>D(提取溫度).

表3 方差分析表

在驗(yàn)證模型有效性時(shí)，對(duì)應(yīng)的P值是要小于 0.000 1 的，由表3可以清楚地看出，試驗(yàn)所得的回歸模型的P值滿足該條件，說明回歸效果極顯著，所以足以證明其有效性.同時(shí)，該模型的私差擬合項(xiàng)(P>0.05)也可以進(jìn)一步說明模型的擬合度不錯(cuò).進(jìn)而表明三萜化合物提取率的預(yù)測(cè)值與實(shí)驗(yàn)值之間具有良好的一致性.

2.3.3 因素間的交互作用

響應(yīng)面圖不僅可以反映提取率的影響因素，還可以體現(xiàn)兩因素之間的交互作用[19-20].通過觀察響應(yīng)面可以判斷出各因素影響的大小.等高線和響應(yīng)面是辨別影響大小的2個(gè)重要因素，當(dāng)前者密集，后者陡峭，則表示兩因素之間的交互作用就較明顯；反之，表示兩因素之間的交互作用就較不明顯.通過利用上述回歸方程做出響應(yīng)面，從而可以更清楚地分析出4個(gè)不同因素對(duì)杏鮑菇三萜化合物提取率的影響.

由圖5可以看出，提取率呈先增大后減小的趨勢(shì).同樣，圖8、圖9兩因素間也呈類似的趨勢(shì)，雖然提取率有最大值，但是因素與因素之間的交互作用不明顯.再由圖6可以看出，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)一定時(shí)，隨著超聲時(shí)間逐漸延長(zhǎng)三萜化合物的提取率呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì).同樣，超聲時(shí)間不變時(shí)，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)百分比的不斷增大三萜化合物的提取率也呈相似趨勢(shì).說明這種情況下三萜化合物的提取率有最大值，而且因素與因素之間的交互作用明顯.同理，圖7、圖10也呈此趨勢(shì)，因此也具有以上特點(diǎn).

圖5 料液比和乙醇體積分?jǐn)?shù)的交互作用 圖6 超聲時(shí)間和乙醇體積分?jǐn)?shù)的交互作用

圖7 提取溫度和乙醇體積分?jǐn)?shù)的交互作用 圖8 超聲時(shí)間和液料比的交互作用

圖9 液料比和提取溫度的交互作用 圖10 提取溫度和超聲時(shí)間的交互作用

2.3.4 最佳工藝條件的驗(yàn)證

為了驗(yàn)證模型的可靠性，對(duì)所得的最佳工藝流程進(jìn)行了實(shí)際試驗(yàn).由 Design expert10 軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)進(jìn)行分析得出最優(yōu)工藝為：乙醇體積分?jǐn)?shù)76.099%、時(shí)間 25.692 min、提取溫度 42.465 ℃、料液比 1∶22.928,模型預(yù)測(cè)三萜化合物提取得率為 296.1 μg/g；考慮到實(shí)驗(yàn)的實(shí)際可操作性將模型的預(yù)測(cè)的最優(yōu)工藝微調(diào)整為：乙醇體積分?jǐn)?shù)76.0%、時(shí)間 25.7 min、提取溫度 42.5 ℃、料液比 1∶23.0，按照提取方法在此條件進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)，獲得最優(yōu)工藝條件下三萜化合物提取平均得率為 287 μg/g，兩者之間的相對(duì)誤差為3.07%，小于5%，說明該模型具有一定的可靠性.

3 結(jié)語

超聲波提取杏鮑菇三萜化合物的最佳工藝條件為：使用76.0%乙醇溶液、物料與乙醇溶液比例1∶23.0(g/mL)，在42.5 ℃條件下超聲提取 25.7 min.在此條件下，杏鮑菇三萜化合物提取率可達(dá) 287.0 μg/g，模型預(yù)測(cè)值為 296.1 μg/g，兩者之間的相對(duì)誤差為3.07%，小于5%，說明該模型具有一定的可靠性.實(shí)驗(yàn)中使用的方法操作簡(jiǎn)便，且對(duì)提取溫度要求較低，提取效率也相對(duì)較高.因此，對(duì)于杏鮑菇三萜化合物的提取可以提供參考.