基于網絡藥理學和分子對接探討銀杏葉治療高血壓病潛在作用機制

劉翠翠，楊 晨，楊 濤，朱俊豪，莊鈺金，顏 軍*，余 能

1成都大學藥學院 四川抗菌素工業研究所 藥食同源植物資源開發四川省高校重點實驗室，成都 610052；2成都農業科技職業學院，成都 611130；3成都晶富醫藥科技有限公司，成都 610041

高血壓是一種以體循環動脈壓升高為特征的慢性心血管疾病，可導致心、腦、腎等器官損傷，同時，也將大幅增加人們患有冠心病、動脈粥樣硬化等心腦血管疾病的概率[1]。隨著人口老齡化加劇，我國高血壓及其導致的心腦血管疾病的患病率不斷增加，高血壓防治已成為我國公共衛生的一項嚴峻挑戰[2]。從高血壓臨床表現來看，中醫學將其歸屬于“肝風”、“頭痛”、“眩暈”等病癥范疇[3]，并分為肝火亢盛、痰濕壅盛、陰虛陽亢、陰陽兩虛4個證型，治療時因人施治、辨證論治[4]。銀杏葉作為銀杏的藥用部位之一，其主要有效成分有黃酮類、萜內脂類、銀杏酸類化合物[5]，具有調節血脂、改善腦血流、抑制血小板活性、抗衰老、抗凋亡等多種藥理作用[6]。目前，銀杏葉制劑已成為治療心腦血管疾病植物藥品種之一[7]，已有多種銀杏葉制劑(如：銀杏葉片、銀杏酮酯、舒血寧注射液、銀杏達莫注射液等)應用于臨床。同時，臨床上使用西藥和銀杏葉制劑對高血壓患者聯合用藥結果顯示，兩種藥物的降壓效果優于單純服用降壓藥，但銀杏葉制劑降壓的成分和機制尚不明確[8]。運用“藥物-靶點-通路-疾病”之間的相互作用網絡來揭示多分子藥物協同作用于疾病的機制的網絡藥理學與中醫學的整體觀以及中藥及其復方多成分、多途徑、多靶點協同作用的原理殊途同歸[9]。由此，該文采用網絡藥理學方法對銀杏葉治療高血壓的潛在機制與作用網絡展開了研究，以便為銀杏葉制劑的臨床應用與研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 網站數據庫和分析軟件

中藥系統藥理學分析平臺TCMSP(https://tcmspw.com/tcmsp.php)；蛋白數據庫UniProt(http://www.uniprot.org/)；靶點預測平臺Swiss Target Prediction平臺(http://www.swisstargetprediction.ch/)；OMIM數據庫(https://omim org)；GeneCards數據庫(https://www.genecards.org/)；DrugBank數據庫(https://www.drugbank.ca/)；STRING數據庫(https://string-db.org/)；DAVID平臺(https://david.ncifcrf.gov/)；微生信網絡平臺(http://www.bioinformatics.com.cn/)；PDB數據庫(http://www.rcsb.org/)；ZINC數據庫(https://zinc.docking.org/)；Cytoscape 3.7.2軟件；AutoDock分子模擬軟件及Pymol。

1.2 主要化學成分及作用靶點的收集與篩選

銀杏葉成分檢索數據庫選用TCMSP(https://tcmspw.com/tcmsp.php)；候選化合物篩選條件為化合物藥動學參數中類藥性(drug-like，DL)≥0.18且口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%；運用TCMSP數據庫檢索候選化合物靶點并通過蛋白質數據庫(UniProt)將其轉化為相應的基因；運用Swiss Target Prediction平臺(http://www.swisstargetprediction.ch/)預測候選化合物潛在靶點。最后合并TCMSP與Swiss Target Prediction數據庫檢索到的化合物靶點并剔除重復基因，即得藥物作用的靶點基因。

1.3 高血壓病相關基因的收集

將“hypertension”作為檢索關鍵詞，在OMIM數據庫(https://omim org)、GeneCards數據庫(https://www.genecards.org/)、DrugBank數據庫(https://www.drugbank.ca/)中進行高血壓病靶點的檢索并刪除重復基因。

1.4 網絡的構建與分析

1.4.1 成分靶點網絡的構建

取化合物的預測靶點與高血壓相關靶點的交集，即得到銀杏葉治療高血壓的預測靶點。然后，在Cytoscape 3.7.2軟件中構建其成分靶點網絡，并以節點表示化合物、靶蛋白，邊表示化合物-靶點的相互作用。運用Cytoscape軟件的“Network Analyzer”功能分析成分靶點網絡的拓撲屬性，計算節點的緊密度(closeness)、介度(betweenness)、連接度(degree)3個重要參數并據此分析銀杏葉治療高血壓的主要活性成分。

1.4.2 構建靶蛋白相互作用網絡

借助STRING數據庫(https://string-db.org/)構建靶蛋白相互作用網絡(PPI)，將“物種”設置為“Homo sapiens”、“最低相互作用閾值”設置為“中等置信度>0.4”，其余參數均保持默認。然后，運用Cytoscape軟件分析PPI網絡拓撲屬性，并篩選其中的關鍵靶點。

1.5 GO生物過程與KEGG通路富集分析

運用DAVID平臺(https://david.ncifcrf.gov/)對銀杏葉治療高血壓的關鍵靶點進行GO、KEGG分析，“物種”選擇為“H.sapiens”，預測銀杏葉治療高血壓病的潛在作用機制。篩選出P<0.05的生物過程與通路，并根據富集基因的多少排序，將前20位的通路導入微生信網絡平臺(http://www.bioinformatics.com.cn/)繪制條形圖和氣泡圖。

1.6 成分—靶點—通路網絡構建

結合相關文獻篩選、分析富集基因數排名前20的KEGG信號通路，得出可能與高血壓相關的信號通路，并找出富集在這些通路上的抗高血壓靶點，再與相應的活性成分配對，從而構建“成分-靶點-通路”網絡。

1.7 分子對接驗證

選取“成分-靶點-通路”網絡中“degree”值排名前3的靶點與對應的活性成分進行分子對接，同時以蛋白配體和一線降壓藥氫氯噻嗪(Hydrochlorothiazide)、呋塞米(Furosemide)為陽性對照，在PDB數據庫(http://www.rcsb.org/)中下載靶點的3D結構“.pdb”格式文件，在ZINC數據庫(https://zinc.docking.org/)中下載化合物3D結構的“.mol2”格式文件。在AutoDock Tools(v1.5.6)中導入靶點的3D結構經過去水、加氫、分配電荷等處理，運用Grid模塊設置蛋白原配體為對接盒子中心，其格點盒子大小設定為40×40×40，將準備好的蛋白文件、配體文件、化合物文件以及腳本放入相應文件夾，利用Autodock_vina 1.1.2分子模擬軟件進行分子對接。然后，用結合能(affinity)來評價化合物與受體的匹配情況，并使用Pymol繪制最佳匹配結果圖。

2 結果

2.1 銀杏葉主要活性成分的篩選

運用TCMSP數據庫檢索出307個銀杏化學成分，再根據OB≥30%、DL≥0.18的原則，篩選出27個化合物，主要含黃酮類如山柰酚(MOL000422)、槲皮素(MOL000098)、異鼠李素(MOL000354)及木犀草素(MOL000006)和銀杏內酯等(見表1)。

表1 銀杏葉活性成分及ADME參數

續表1

圖1 銀杏葉活性成分與交集靶點相互作用網絡圖Fig.1 Interaction network between active components and intersection targets in GBL注：六邊形節點代表活性成分；菱形節點代表靶點。Note:The hexagonal node represents the active component;The rhombic node represents the target.

2.2 藥物疾病靶點篩選結果

運用TCMSP、Swiss Target Prediction平臺分別檢索出470、1 328個潛在靶點，刪除成分間重復靶點后分別獲得218、354個潛在靶點，將其合并、剔除重復靶點后得到480個潛在靶點。然后，在OMIM、DrugBank、GeneCards三個在線數據庫中挖掘出了1 136個高血壓相關靶點。至此可知，兩個數據集的交集(190個)即為銀杏葉治療高血壓的潛在靶點。與篩選出的27個主要活性成分匹配后得到22個具有降壓作用的活性成分。

2.3 網絡圖分析

2.3.1 成分靶點網絡

將銀杏葉中可能具有降壓作用的22個活性成分及190個交集靶點數據導入Cytoscape 3.7.2軟件，構建成分靶點網絡圖，見圖1。結果顯示，共有212個節點，形成762個關系對。該成分靶點網絡degree平均值為7.19，介值中心度(betweenness centrality，BC)平均值為0.009 8，緊密中心度(closeness centrality，CC)平均值為0.34，這表明銀杏葉中多成分、多靶點相互作用。靶點數排名前5的成分分別為槲皮素(quercetin)、山柰酚(kaempferol)、木犀草素(luteolin)、異鼠李素(isorhamnetin)、金圣草(黃)素(chryseriol)，揭示這些成分可能是銀杏葉治療高血壓的有效成分，拓撲參數見表2。

表2 銀杏葉-活性成分-關鍵靶點-疾病網絡拓撲分析

2.3.2 靶蛋白PPI網絡分析

在STRING數據庫中進行PPI網絡分析，設置置信度≥0.4得到187個靶點、形成3 093個蛋白互作關系對，且有3個無蛋白相互作用靶點，見圖2。因網絡節點“degree”中位數為25，故以“degree”大于等于2倍中位數的值為篩選條件，即“degree≥50”，篩選出44個候選靶點；然后對其進行degree、betweenness以及closeness計算分析，再篩選出大于中位數的靶點，得到20個關鍵的治療高血壓靶點(見圖3)。將這20個靶點與對應成分進行匹配后，按照度值篩選前五位成分為槲皮素、木犀草素、山柰酚、金圣草(黃)素、異鼠李素，與之前得到的靶點數前五的成分一致，說明這五個成分為銀杏葉治療高血壓的關鍵成分。

2.4 GO生物過程和KEGG通路富集分析

運用DAVID 6.8數據庫對上文中得到的20個關鍵治療高血壓靶點進行GO分析，得到248個條目。并且，以P<0.05為篩選條件，篩選出208個有效條目。其中，182個生物過程條目、10個細胞組成條目、16個分子功能條目。圖4所示的是篩選出的最低P值的10個條目并將其升序排列的情況。結果顯示，生物過程主要涉及一氧化氮生物合成過程的正調控(positive regulation of nitric oxide biosynthetic process)、藥物反應(response to drug)、平滑肌細胞增殖的正調控(positive regulation of smooth muscle cell proliferation)及血管生成(angiogenesis)等，細胞組成中主要影響細胞外空間(extracellular space)、細胞外區域(extracellular region)、小窩(caveola)、蛋白質復合物(protein complex)；分子功能主要包括相同蛋白結合(identical protein binding)、酶結合(enzyme binding)、蛋白質結合(protein binding)、細胞因子活性(cytokine activity)等方面。

圖2 銀杏葉治療高血壓病靶點的蛋白質相互作用(PPI)網絡圖Fig.2 Protein protein interaction (PPI) network of GBL as a target for the treatment of hypertension

圖3 PPI網絡篩選Fig.3 PPI network screening注：藍色代表度值小于50的靶點；紅色代表度值大于50的靶點；黃色代表度值大于67、介度大于5.466、緊密度大于0.896的靶點。Note:The blue represents targets with degree value less than 50;The red represents targets with degree value greater than 50;The yellow represents targets with degree value greater than 67,betweenness greater than 5.466,and closeness greater than 0.896.

再對這20個關鍵靶點進行KEGG信號通路分析并以P<0.05為篩選條件，得到90條信號通路。然后，按P值大小升序排列，前20位的信號通路分別是乙型肝炎(Hepatitis B)、TNF信號通路(TNF signaling pathway)、Toll樣受體信號通路(Toll-like receptor signaling pathway)、HIF-1信號通路(HIF-1 signaling pathway)、MAPK信號通路(MAPK signaling pathway)等(見圖5)。

圖4 銀杏葉活性成分GO生物過程分析Fig.4 Biological process analysis of active component go in GBL

圖5 銀杏葉活性成分-靶點KEGG通路富集分析Fig.5 Enrichment analysis of active components target KEGG pathway in GBL

2.5 活性成分-靶點-信號通路網絡

從KEGG排名前20的信號通路中篩選出可能與高血壓相關的10條，并將其與銀杏葉的活性成分、作用靶點一一對應，構建“成分—靶點—通路”多維網絡(見圖6)。圖中度值越大，節點越大，顏色越深。由此分析可得，銀杏葉治療高血壓涉及的活性成分共21個，關鍵成分有槲皮素、山柰酚、木犀草素、異鼠李素、金圣草黃素等，靶點有PTGS2、ATK1、EGFR、TNF等，主要涉及乙型肝炎、TNF信號通路、甲型流感、結核、MAPK信號通路等。

圖6 銀杏葉活性成分-靶點-信號通路網絡Fig.6 Active components target signal pathway network of GBL注：菱形節點為活性成分；箭頭節點為靶點；圓形節點為信號通路。Note:Rhombus node is the active component;Arrow node is the target;Round node is signal pathway.

2.6 分子對接結果

選取“成分-靶點-通路”網絡中“degree”值排名前3的靶點PTGS2、ATK1、EGFR作為銀杏葉治療高血壓的潛在作用靶點，與核心活性成分槲皮素、山柰酚、木犀草素、異鼠李素、金圣草黃素以及蛋白配體、一線降壓藥氫氯噻嗪、呋塞米進行分子對接(見表3)。一般情況下，對接評分的絕對值越大，化合物與靶點的結合力越強、構象也越穩定。絕對值>4.25時，說明化合物與靶點可能結合；絕對值>5.0時，說明結合能力較高；絕對值>7.0時，說明結合能力高[10]。分子對接結果顯示，化合物與靶蛋白的最低結合能都小于0，說明配體與受體可以自發結合。其中金圣草黃素、木犀草素、異鼠李素與PTGS2、ATK1、EFGR等結合能絕對值均大于其他化合物與一線降壓藥氫氯噻嗪、呋塞米，其中金圣草黃素、木犀草素、異鼠李素與EGFR的結合能絕對值高于蛋白配體，表明其具有強的結合能力。分子對接模式如圖7所示。分析表明木犀草素(a)與PTGS2共形成9個氫鍵，金圣草黃素(b)與PTGS2共形成9個氫鍵，槲皮素(c)與PTGS2共形成8個氫鍵，說明活性成分與靶蛋白具有較強的親和力，且結合體構象穩定。綜合分析，槲皮素、山柰酚、木犀草素、異鼠李素、金圣草黃素可能是銀杏葉治療高血壓的關鍵成分。

3 討論

高血壓的危險因素與遺傳、年齡、體重、飲食、生活習慣等多種因素相關。中醫認為證候要素以陰虛、氣虛、痰、血虛等為主，肝與腎臟是受高血壓影響的主要靶器官。現代醫學認為：高血壓的發病機制與腎素-血管緊張素-醛固酮系統、粘附分子和細胞因子表達的增加、水鈉潴留、免疫細胞活化和浸潤、炎癥反應和氧化應激的形成等有關。這些系統或功能長期紊亂，會破壞血管內穩態，使血管平滑肌細胞肥大、血管舒縮功能失調、外周阻力增加等而造成血壓升高[11]。

表3 銀杏葉活性成分與高血壓潛在作用靶點的分子對接結果

圖7 分子對接模式圖Fig.7 Molecular docking pattern注：a.PTGS2-木犀草素；b.PTGS2-金圣草黃素；c.PTGS2-異鼠李素；d.AKT1-木犀草素；e.AKT1-金圣草黃素；f.AKT1-異鼠李素；g.EGFR-木犀草素；h.EGFR-金圣草黃素；i.EGFR-異鼠李素。Note:a.PTGS2-Luteolin;b.PTGS2- Chryseriol;c.PTGS2-Isorhamnetin;d.AKT1-Luteolin;e.AKT1- Chryseriol;f.AKT1-Isorhamnetin;g.EGFR-Luteolin;h.EGFR-Chryseriol;i.EGFR-Isorhamnetin.

對銀杏葉治療高血壓的作用網絡與潛在機制的研究結果表明：銀杏葉中可能含有21個成分對治療高血壓有顯著效果，其中槲皮素、山柰酚、木犀草素、異鼠李素、金圣草黃素為關鍵成分，銀杏內酯等作為協同作用成分。槲皮素和山柰酚等具有顯著的心臟相關益處，如抑制LDL氧化、非內皮依賴性血管擴張劑的作用；減少粘附分子和其他炎癥標記，在氧化應激條件下對一氧化氮和內皮功能的保護作用；還可預防神經元氧化和炎性損害以及血小板的抗凝集作用[12]。已有研究表明氧化應激是高血壓的重要促成因素，并且在高血壓腎損害中起著關鍵作用。銀杏內酯具有抗氧化應激作用，提高高血壓腦出血治療效果，對高血壓腦出血患者神經功能的恢復具有積極作用[13]，同時，銀杏內酯還可協同作用銀杏黃酮有效清除過量氧自由基[14]。此外，該文收集到的銀杏葉190個治療高血壓的靶點，表明銀杏葉治療高血壓不是單一成分或靶點的作用，而是多成分、多靶點協同作用的結果。

從構建的PPI網絡可知，銀杏葉與高血壓靶點存在密切相互作用，核心靶點有20個，主要與PTGS2、AKT1、EGFR、TNF、MMP9、MAPK1、STAT3、EGFR、MMP2、IL6等有關。研究表明，心血管疾病的病理生理和高血壓炎癥機制的發生與血管、腎臟和血管周圍脂肪組織中免疫細胞的浸潤息息相關[15]。其中，JUN是AP-1(激活子蛋白-1)的組成之一，而AP-1可誘導炎癥因子白介素6(IL6)、白介素10(IL10)、腫瘤壞死因子(TNF)等的表達，引起血管內皮細胞及炎癥細胞的增殖，血管阻力增大從而導致血壓升高[16]。前列腺素內源性過氧化物合酶(PTGS2)能夠激活分布在血小板和內皮細胞上的前列環素受體G蛋白，從而松弛血管平滑肌及抑制血小板聚集，降低血壓[17]。VEGFA為血管內皮細胞生長因子，可誘導新血管生成，調節血管張力，在調節病理性血管生成中起著核心作用[18]。血管內皮障礙相關基因MAPK1、AKT1等參與了MAPK信號通路，從而促進血管內皮細胞的增殖與血管生成，并與高血壓的發生密切相關[19]。黃酮類成分能有效抑制炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β和VCAM-1的產生，并增強抗氧化能力[20]。同時，銀杏葉中的銀杏內酯也可降低IL-6、TNF-α、MMP9等炎癥因子水平，改善炎癥反應[21]。那么，銀杏葉極有可能是通過控制炎癥反應、改善血管內皮功能障礙，進而起到治療作用。

進一步對其進行GO分析和KEGG通路分析，GO富集分析顯示：銀杏葉治療高血壓主要通過對一氧化氮生物合成過程和平滑肌細胞增殖的正調控、血管生成等生物過程發揮作用。KEGG通路富集結果顯示，乙型肝炎、TNF信號通路、Toll樣受體信號通路、HIF-1通路、MAPK信號通路等是銀杏葉降壓的主要通路。研究表明：HIF-1α、VEGF信號通路被認為是治療與血管生成有關的疾病的重要靶標[22]；HIF還可激活控制細胞氧穩態的基因，包括與耗氧、紅細胞生成、血管生成和線粒體代謝有關的基因[23]。這正好佐證了GO富集分析結果中影響NO的生物合成與血管生成等生物過程。同時，槲皮素能顯著抑制TLR4-NF-κB通路，減少炎癥因子釋放，從而改善心室重構[24]；木犀草素通過激活Toll樣受體4(TLR4)、TNF受體相關因子6(TRAF6)、核轉錄因子-κB(NF-κB)信號通路，降低了腦出血誘發的細胞因子的釋放[25]；銀杏內酯可通過抑制IL-1β、TNF等信號通路，從而控制炎癥反應、抑制血管內皮細胞凋亡、改善組織血流量[26]。

綜上所述，該文系統地分析了銀杏葉治療高血壓的作用機制，揭示了銀杏葉治療高血壓潛在的活性成分、作用網絡和潛在作用機制，證明了銀杏葉治療高血壓具有多成分、多靶點、多通路協同作用的特點，為進一步藥效物質基礎分析和作用機制研究提供方向，其后期需要實驗進一步驗證相關通路間的關系。